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1、本文格式为Word版，下载可任意编辑黄连油化学成分分析安全性和体外抗炎活性研究 韩进华李生慧于钰 黄连油来源于临床上广泛用于治疗皮肤生理损伤病的经典中药方剂黄连膏，通过GC-MS方法分析鉴定了黄连油的主要活性成分，HET-CAM、人体皮肤重复性开放型涂抹试验分析黄连油刺激性和安好性，体外细胞测验举行其抗炎活性的研究。研究结果显示，黄连油中含有多种不饱和脂肪酸和多种活性成分。HET-CAM结果显示刺激评分小于1，预示黄连油无眼刺激或轻度刺激，人体皮肤重复性开放型涂抹试验结果显示黄连油刺激性较小，安好性较高，适合问题肌肤人群使用。黄连油通过抑制因子TNF-、IL1-、IL-6和IL-8分泌活释放来
2、发挥抗炎作用。结果说明，黄连油含有多种有效成分，性质温柔，刺激性低，对皮肤具有良好的抗炎作用，在皮肤护理品中具有良好的应用前景。 近年来，越来越多的人受到皮肤问题的困扰，如湿疹、过敏等，针对问题肌肤人群开发一款温柔有效的护肤品迫在眉睫。黄连油来源于临床上广泛用于治疗皮肤生理损伤病的经典中药方剂黄连膏，以芝麻油为溶剂，提取黄连、姜黄、黄柏、生地黄、当归中的有效成分。方剂中，黄连清热利湿，姜黄破血行气，黄柏清火解毒，生地清热生津，凉血滋阴润燥，当归活血养血。在医院皮肤科、烧伤科、普外科等科室应用中具有稳当的临床效果，其对皮肤湿疹，烧烫伤、痔疮、新生儿红屁股、褥疮、粉刺等有梦想的治疗效果。 炎症是大
3、多数皮肤生理损伤疾病的正常生理回响，可由微生物感染和组织损伤引发。它的特点是大量促炎介质释放，如一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子TNF-、白细胞介素、IL-1、IL-6和IL-8，它们被认为是开发抗炎药的重要目标。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的重要组成片面，不仅能诱导促炎细胞因子的释放，还能促进炎症介质的产生，被认为是导致炎症的因素之一。巨噬细胞作为免疫细胞具有多种功能，不仅可以除掉细胞碎片和病原微生物，还可以分泌细胞因子和其他介质。小鼠RAW264.7细胞具有稳定性好、可持续传代培养等优点。因此，LPS诱导的RAW264.7细胞常被用作体外测验中的体外炎症细胞模型。 本研究主要分析了黄连油的化学
4、成分，评估了黄连油的刺激性和安好性。此外，选择“LPS-巨噬细胞”作为炎症模型来评估黄连油的抗炎作用，为其作为问题肌肤护理产品的开发使用供给科学依据。 01.材料与方法 1.1材料 3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑（MTT）购自Biodee bio生物有限公司（中国北京）;脂多糖（LPS）购自Sigma（USA）;胎牛血清（FBS）购自Biological Industries（ISRAEL）;DMEM（H）、二甲亚砜（DMSO）购自索莱宝生物科技有限公司（中国北京）;小鼠IL-6 ELISA试剂盒、小鼠IL-1ELISA试剂盒、小鼠IL-8 ELISA试剂盒、小鼠T
5、NF-ELISA试剂盒、组织上清液NO试剂均购自南京建成生物工程研究所（中国南京）;鸡胚胎为购自新兴大华农家禽蛋有限公司（中国广州）。研究中所用其他溶剂和化学品均为分析纯。 1.2方法 1.2.1黄连油的制备 取适量黄连、姜黄、生地、黄柏、当归尾并举行粉碎后，参与适量芝麻籽油，于150下将药材炸枯，冷却至室温并过滤，弃药渣，即得黄连油。 1.2.2黄连油成分分析 通过气相色谱质谱仪（Thermo Scientific，TRACE 1310）、热解气相色谱质谱仪（Thermo Scientific，TRACE 1310;Frontier，EGA/PY-3030D）和顶空气相色谱质谱仪（Therm
6、o Scientific，TriPlus 500、TRACE 1310）对黄连油举行成分分析，通过计算机完成总离子流图谱分析，同时通过NIST11S检索定性比对，并利用谱图计算峰面积，从而进一步得到黄连油成分的相对分子质量。 1.2.3黄连油安好试验 1.2.3.1鸡胚绒毛尿囊膜试验 取9日龄鸡胚（SPF级，白来杭鸡）举行蛋检，在蛋壳外观标记气室位置;用牙科锯齿弯钳剥离标记的蛋壳片面，露出白色的蛋膜，参与适量生理盐水润湿蛋壳膜，然后用弯性牙科小镊子提防地剥离蛋壳膜，露出尿囊膜。肉眼查看尿囊膜的完整性及有无出血点的变化。假设有出血点或尿囊膜（CAM）破损那么剔除，不能用于进一步的测试。应留神提防
7、操作不要破坏蛋膜的完整性。 取0.3mL黃连油原液，直接滴在CAM外观，查看CAM回响，并在作用后5min内记录每种毒性作用展现的时间。每个样品做6个有效鸡胚。阳性对照为1%SDS;阴性对照为生理盐水。 结果计算与评估： 在公式： sec HCAM膜上开头查看到开头发生出血的平均时间，单位为秒（s）; sec LCAM膜上开头开头发生血管溶解的平均时间，单位为秒（s）; sec CCAM膜上开头查看到开头展现凝血的平均时间，单位为秒（s） 根据计算的IS数值按表1对受试物眼刺激性举行分类。 1.2.3.2皮肤重复开放式斑帖试验 参照我国2022年版打扮品安好技术模范中人体皮肤斑贴试验的方法。选
8、取符合要求的30名志愿者，选取受试者前臂弯曲侧33cm2区域涂黄连油0.05 mL，每天2次，连续了天，查看皮肤回响。150g*L-1SDS溶液为阳性对照，生理盐水为空白对照。人体重复开放式涂片试验，判断标准见表2。 1.2.4黄连油的抗炎作用 1.2.4.1细胞培养和细胞活力测定 小鼠巨噬RAW264.7细胞系购自中国科学院细胞资源中心（中国上海），在5%CO2的加湿培养箱中培养，37，DMEM（H）添加10%FBS和1%链霉素/青霉素。将细胞以5103个细胞/孔接种在96孔板中。24h后，吸出上清液后，参与100L/孔的MTT溶液（终浓度，1mg*mL-1），371培养4 h。然后吸出上清
9、液，用150L DMSO溶解甲躜晶体。使用Azure Biosystem酶标仪（Azure AO，USA）在570nm处测定每个孔的光密度。 细胞存活率计算公式： 细胞存活率=（测定组吸光度-空白对照组吸光度）/（细胞对照组吸光度-空白对照组吸光度）100%。 1.2.4.2“LPS-巨噬细胞”炎症模型的建立和细胞因子的测定 将细胞以5103个细胞/孔接种到96孔培养板上。接种24h后，不同浓度LPS（100g*mL-1、75g*mL-1、50g*mL-1、25g*mL-1、10g*mL-1、5g*mL-1、2.5g*mL-1、1g*mL-1）刺激24h。结合细胞活力和炎症因子（NO）水平确定
10、LPS的最正确刺激回响条件，建立炎症模型举行后续试验。 按照产品说明书使用ELISA试剂盒测量细胞上清液中INF-、Ib-1、IL-6和IL-8的水平。按照产品说明书测量细胞培养物上清液中的NO水平。 细胞因子抑制率=（模型组-试验组）/模型组*100% 1.2.4.3药物处理 将细胞以5103个细胞/孔接种到96孔培养板上。接种24h后，不同浓度的黄连油（使用DMSO增溶使其终浓度为：50 L*mL-1、10L*mL-1、5L*mL-1 1L*mL-1、0.5L*mL-1、0.1L*mL-1、0.05L*mL-1）在371下培养细胞24h后，MTT法测定细胞活力。根据细胞存活率选择适合浓度举
11、行后续炎症因子的测定试验。 将细胞以5103个细胞/孔接种到96孔培养板上24h后，合有LPS（终浓度5pg*mL-1）和不同浓度黄连油中371下培养细胞24h后，取上清液，举行细胞因子的测定。 02.结果 2.1黄连油化学成分分析 黄连油的化学成分分析采用气相色谱质谱仪、热解气相色谱质谱仪和顶空气相色谱质谱仪。使用质谱数据系统获得相关峰的留存时间数据。黄连油的定性和定量化学成分分析结果见表3。 2.2黄连油安好试验 2.2.1鸡胚绒毛尿囊膜试验 鸡胚绒毛膜尿囊膜试验结果显示（见表4），黄连油组6只鸡胚5min后无出血、凝固或血管溶解。刺激评分小于1，预示黄连油对眼睛无刺激或刺激很小。 2.2
12、.2皮肤重复开放涂片试验 对30名受试者的前臂受试部位查看了天，结果显示（表5）无红斑、皮肤枯燥、皱纹、红斑、水肿、丘疹、脱屑等现象，说明该配方黄连油刺激性小，安好性较高，适合问题性肌肤人群的使用。 2.3黄连油的抗炎作用 2.3.1“LPS-巨噬细胞”炎症模型的建立 用不同浓度的LPS刺激巨噬细胞24h后，检测巨噬细胞的存活率和上清液中NO的含量。当LPS浓度为5g*mL-1时，细胞存活率最大，上清液中NO含量最大（见图-1）。因此，以浓度为5g*mL-1LPS刺激RAW264.7细胞建立“LPS-巨噬细胞”炎症模型用于以下测验。 2.3.2黄连油对巨噬细胞的毒性试验 巨噬细胞在合不同黄连油
13、的培养基中培养24h后，MTT法检测细胞活力。结果如图-2所示。黄连油浓度为（0.05-20）pL*mL-1，细胞存活率大于80%;当浓度为1L*mL-1时，巨噬细胞的存活率最大。选择浓度为1L*mL-1、5L*mL-1、10L*mL-1的黄连油，用于后续细胞因子测定。 2.3.3细胞因子抑制率 巨噬细胞在含有LPS（终浓度5pg*mL-1）和黄连油（终浓度1、5、10L*mL-1）的培养基中培养24h后，取上清液测定因子TNF-、IL-1、IL-6、IL-8水平并计算抑制率。结果（图-3）说明黄连油对TNF-、IL1-、IL-6和IL-8的水平有较强的抑制作用，10L*mL-1的黄连油对TN
14、F-、IL-6、IL-8有明显的抑制作用;1L*mL-1黄连油对IL-1有明显抑制作用。 03.议论 细胞因子是细胞释放的生物活性物质的小分子，可以通过多种方式参与调理免疫回响和炎症回响。LPS是炎症过程中最早和最重要的炎症介质，可以诱导和刺激巨噬细胞分泌TNF-G、IL-1、IL-6和IL-8等炎性细胞因子，可激活中性粒细胞和淋巴细胞，增加血管内皮细胞的通透性，调理其他组织的代谢活性，促进其他细胞因子的合成和释放。IL-1是诱发炎症回响的重要介质之一，它能激活多种免疫细胞和炎症细胞，并与TNF-协同作用，诱发炎症和机体防卫回响。IL-6来源于TNF-和IL-1诱导的细胞和组织，参与体内信号分
15、子的传递引起炎症I，诱导B细胞分化产生抗体，并诱导T细胞激活增殖分化，参与机体免疫回响，是炎症回响的触发器。L-8可刺激中性粒细胞、T淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的趋化性，促进中性粒细胞脱粒，释放弹性蛋白酶，损伤内皮细胞，引起微循环血流瘀滞，组织坏死，造成脏腑功能障碍，其含量可以反映體内炎症和组织损伤的程度。 在本研究中，黄连油以芝麻籽油为溶剂，提取黄连、姜黄、黄柏、生地、当归尾。结果显示，黄连油含有多种活性成分，脂肪酸包括亚油酸（37.58%）、油酸（24.6%）、棕榈酸（5.35%）等;活性成分包括姜黄素（9.10ug）/mL）、阿魏酸（12.20ug/mL）、盐酸小檗碱等。黄连油对TNF-、IL1-、IL-6和IL-8的水平有很强的抑制作用。黄连常用于治疗炎症性疾病的中药方剂。据报道，黄连的抗炎作用与五种生物碱（小檗碱、黄连素、表小檗碱、巴马汀和药根碱）的含量呈正相关。黄连素抑制核因子KB抑制剂（lKBa）的降解和细胞外信号调理激酶（ERK）、c-Jun NH2末端激酶（JNK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷酸肌醇3-激酶/Akt（PI3K/Akt）的磷酸
