第七章化学检测1培训讲学

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1、第七章 化学检测技术1化学检测技术特点：化学检测技术特点：根据物质的化学性质而对物质进行定量、定性测定。应用最早、最广泛的检测技术简便、快速、操作容易2一.前言n化学检测是根据物质的化学性质而对物质进行定性、定量测定的方法，主要包括： 1.糖类化学检测 2.蛋白质化学定量检测 3.蛋白质氨基酸序列检测 4.蛋白质免疫化学检测 5.核酸化学检测3第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 糖类物质的测定方法糖类物质的测定方法 相对密度法相对密度法折光法折光法 旋光法旋光法物理法物理法 物理法物理法 化学法化学法 色谱法色谱法 发酵法发酵法 酶酶 法法 重量法重量法5第一节第一节 糖类的化学检测糖

2、类的化学检测 直接滴定法直接滴定法 (改良的改良的兰兰爱农法爱农法） 高锰酸钾法高锰酸钾法 萨氏法萨氏法 3，5二硝基水杨酸二硝基水杨酸 酚酚硫酸法硫酸法 蒽酮法蒽酮法 半胱氨酸半胱氨酸咔唑法咔唑法化学法化学法还原糖法还原糖法碘量法碘量法比色法比色法糖类检测的化学法糖类检测的化学法61.兰爱农法n此法以次甲基蓝为指示剂，直接用糖液滴定到斐林试剂中进行测定； 或者将糖液加到斐林试剂中，再用标准葡萄糖液反滴定。又称置换法，直接滴定法或者次甲基蓝法。 8n1.1原理 糖液滴到斐林试剂中时，还原糖中的游离羰基与酒石酸钾钠铜反应，使二价铜离子还原生成一价的氧化亚铜沉淀。 由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，

3、当二价铜离子全部被还原后，过量一滴还原糖立即使次甲基蓝还原，溶液的蓝色消失，从而显示反应终点。9第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 还原糖的测定还原糖的测定方法方法兰爱农（Lane-Eynon）法： 斐林试剂甲液：硫酸铜斐林试剂甲液：硫酸铜+ +次甲基蓝次甲基蓝 斐林试剂乙液：酒石酸钾钠斐林试剂乙液：酒石酸钾钠 + NaOH + + NaOH + 亚铁氰化钾亚铁氰化钾 乙酸锌溶液乙酸锌溶液 亚铁氰化钾溶液亚铁氰化钾溶液 葡萄糖标准溶液：准确称取经葡萄糖标准溶液：准确称取经 98 98 100 100 干燥至恒重干燥至恒重的无水葡萄糖，加水溶解后移入的无水葡萄糖，加水溶解后移入1000

4、m11000 m1容量瓶中，加容量瓶中，加入入5m15m1盐酸盐酸( (防止微生物生长防止微生物生长) )。10第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 操作要点操作要点（1 ）斐林试剂的标定（a）标定预备试验 A、B各5mL10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，2滴1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1或0.2）V1mL。（b）标定 A、B各5mL10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，从滴定管中预先加入（V1-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，2滴1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的

5、总毫升数V011第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 (2) 定糖（a）定糖预备试验A、B各5mL10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，2滴1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1或0.2）V2mL。（b）定糖A、B各5mL10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，补加（V0-V2）mL水，并从滴定管中预先加入（V2-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，2滴1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V12第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 (3) 计算还原糖含量（以葡

6、萄糖计） （V0-V) c (1/10 )n注意：（a）AB分开储存，防止Cu+变化，临用混合（b）单标移液管吸液准确，外壁也需擦干净（c）体积需控制在一定范围内，对pH有影响（d）煮沸时间要一致（e）注意指示剂加入时间和加入量一致（f）滴定速度一致（后滴定0.51mL，1min内完成）（g）产物Cu2O不稳定，次甲基蓝变色也不稳定，暴露于空气或沸腾颜色变化，滴定过程不能摇动，不可中途中止加热 13第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 斐林试剂快速法：斐林试剂快速法： 在斐林试剂中加入亚铁氰化钾（黄血盐）反应终点为蓝色消失，淡黄色出现。反应终点比兰爱农法更为明显。 其特点是试剂用量少，操

7、作和计算都比较简便、其特点是试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，滴定终点明显。快速，滴定终点明显。14n2.2实验操作 2.2.1斐林试剂的标定 吸取斐林甲、乙液各5ml，置于250ml三角瓶内，加10ml水，从滴定管中预先加入约20ml0.1标准葡萄糖液，摇匀后于电炉上加热至沸，立即用标准葡萄糖液继续滴定至蓝色消失。记录消耗葡萄糖液的总毫升数V0。15n2.2.2 样品含糖量测定 吸取斐林甲、乙液各5ml，置于250ml三角瓶内，加入样品稀释液10ml，及适量的0.1标准葡萄糖液。摇匀后按标定时相同操作进行。记录消耗标准葡萄糖液的毫升数（V)。16n2.2.3 计算还原糖含量（）（V0-

8、V)*c*N/10 式中，V0斐林试剂标定值，ml V样品糖液测定值，ml c标准葡萄糖液浓度，g/ml 10样品液体积，ml N样品稀释倍数173.碘量法3.1 原理 此法是利用碘与氢氧化钠反应生成次碘酸钠，氧化还原糖的自由醛基，过量的碘再用硫代硫酸钠滴定，从而测定糖的含量。 次碘酸钠氧化能力比较弱，所以只适用于醛糖的滴定，与酮糖不起反应。18第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 I2 NaIO(氧化剂），其氧化能力较弱，仅适用于醛糖的测定，与酮糖不起反应操作要点：（1）标准硫代硫酸钠溶液配制，0.05 mol/L，沸腾后冷却水配制，存放在棕色瓶中，一周后用标准重铬酸钾标定。（2）标准

9、碘液配制，0.1mol/L（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸钠滴定试剂中全部碘醛糖醛糖 + I2 +3 NaOH = 醛糖酸钠醛糖酸钠 + 2 NaI +2H2OI2 + 2 NaOH = NaIO + NaI + H2ONaIO + NaI + 2 HCl = I2 + 2 NaCl + H2O19第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 碘量瓶中，10mL0.1mol/L碘液15mL0.1 mol/LNaOH5mL空白液，摇匀后暗反应15min1mL1mol/L硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加0.2mL0.5淀粉液作指示剂，滴定至蓝色消失，记录V0(4)样品滴定：

10、以5mL样品液代替空白液， V1(5) 计算：醛糖含量 （V0 V1）C M n注意：暗反应后需酸化再滴定，滴定时开始轻摇（碘挥发），后再摇（淀粉吸附碘）配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如果糖）配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如果糖）204.铜试剂法n4.1 原理 铜试剂提供二价铜离子和碘，还原糖与二价铜离子反应生成的氧化亚铜被碘氧化，再用硫代硫酸钠滴定反应液中剩余的碘，从而测定样品中还原糖的含量。 铜试剂中适当增加或减少硫酸铜和碘酸钾的量，就可测定不同范围的糖的含量。 21n4.2 实验操作 4.2.1 铜试剂配制 4.2.2 标准曲线制作： 4.2.2.1 配制葡萄糖标准液 4.2.2.2 取

11、6个三角瓶，分别加入0、1、2、3、4、5ml标准葡萄糖液和5、4、3、2、1、0ml蒸馏水。 4.2.2.3 各瓶加入5ml铜试剂。置于沸水浴中加热10min，冷却至室温。224.2.2.4 加入0.5mol/L硫酸5ml，振荡。待红色氧化亚铜沉淀完全溶解后，立即用0.005mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加数滴淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失。记录所用硫代硫酸钠毫升数。 4.2.2.5 以葡萄糖含量为纵坐标，以空白滴定值减去标准样品滴定值得出的硫代硫酸钠毫升数为横坐标，绘标准曲线。4.2.3 样品的含糖量测定 将还原糖样品液适当稀释，取5ml样品液代替标准葡萄糖液，按上述方法进行测定。 测

12、样品中总糖含量，则样品经过水解后，按还原糖含量测定方法进行测定。 测淀粉或半纤维素含量时，水解后测定的还原糖量要乘上系数0.9。 235.比色法测糖 上述4种糖检测方法都是通过滴定的方法进行糖含量的测量；此外，我们还可以通过比色法等检测糖的含量，主要有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和DNS法等，其原理分别如下：24n5.1苯酚-硫酸法原理 苯酚硫酸法主要用于多糖检测。其原理是：多糖在浓硫酸作用下水解成单糖,并迅速脱水生成糠醛衍生物,随后与苯酚结合生成有色化合物,从而可以利用分光光度计测定其吸光度,并利用标准曲线定量测定样品中的多糖含量。n5.2 蒽酮-硫酸法原理 非还原性糖在浓硫酸催化下，迅速水解

13、为还原糖。还原糖与浓硫酸作用形成5-羟甲基糠醛，5-羟甲基糠醛，与蒽酮反应生成蓝绿色物质，在625nm处有最大吸收值。25n5.3 DNS法原理 3,5- 二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件下与多糖水解的还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物3-氨基- 5- 硝基水杨酸, 在一定范围内, 还原糖的量和反应液的颜色呈正比。 265.4 DNS法测发酵残糖5.4.1 标准曲线的绘制 预先配制好1mg/ml葡萄糖标准液。取6支具塞比色管，编号，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8及1ml的葡萄糖标准液，再补充蒸馏水至2ml，分别添加DNS试剂3ml。将各管溶液混合均匀，在预先加热好的沸水中加热5m

14、in，取出立即用自来水冷却至室温，再向每管补充蒸馏水至25ml，小心摇匀。 在分光光度计上，测520nm波长处溶液的OD值。以葡萄糖mg数为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线 。275.4.2 发酵残糖的测定 准确吸取已分离菌体后的发酵液1ml，用蒸馏水稀释至适当倍数得到稀释液。精确吸取稀释液1ml，按照5.4.2中的方法测定OD值，根据DNS法标准曲线和稀释倍数计算发酵液残糖含量。 28 注意事项： a.实验中OD值最好在0.20.8范围内。发酵液中残糖比较高，所以可能需要进行预备实验，根据实验结果对发酵液进行适当的稀释。 b.发酵液和其他试剂在具塞试管内要充分混合均匀。 c.沸水浴的时间

15、要严格掌握好，时间过长会使溶液颜色加深，实验误差变大。29第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 蔗糖是葡萄糖和果糖组成的双糖，没有还蔗糖是葡萄糖和果糖组成的双糖，没有还原性，不能用碱性铜盐试剂直接测定，但在一定原性，不能用碱性铜盐试剂直接测定，但在一定条件下，蔗糖可水解为具有还原性的葡萄糖和果条件下，蔗糖可水解为具有还原性的葡萄糖和果糖（转化糖）。因此，可以用测定还原糖的方法糖（转化糖）。因此，可以用测定还原糖的方法测定蔗糖含量。对于纯度较高的蔗糖溶液，其相测定蔗糖含量。对于纯度较高的蔗糖溶液，其相对密度、折光率、旋光度等物理常数与蔗糖浓度对密度、折光率、旋光度等物理常数与蔗糖浓度都有一

16、定关系，故也可用物理检验法测定。这里都有一定关系，故也可用物理检验法测定。这里介绍还原糖法。介绍还原糖法。蔗糖的测定蔗糖的测定30第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 淀粉的测定方法有多种，部分是根据淀粉的理淀粉的测定方法有多种，部分是根据淀粉的理化性质而建立的。常用的方法有：化性质而建立的。常用的方法有： 酸水解法酸水解法 酶水解法酶水解法 旋光法旋光法 酸化酒精沉淀法。酸化酒精沉淀法。淀粉的测定方法淀粉的测定方法31第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 酸水解法酸水解法 （一）（一） 原理原理 样品经乙醚除去脂肪，乙醇除去可溶性糖类后，用盐酸水解淀粉为葡萄糖，按还原糖测定方法测定还原糖含量，再折算为淀粉含量。淀粉水解 于250m1锥形瓶中加入30 ml 6 mol/L盐酸，装上冷凝管，置沸水浴中回流 2 h ,速冷。蔗糖水解：于250m1锥形瓶中加入5 ml 6 mol/L盐酸，置6870水浴中15 min ,速冷。32第一节第一节 糖类的化学检测糖类的化学检测 酶水解法酶水解法（一）（一） 原理：原理：含淀粉含淀粉 糊精、麦芽糖糊精、麦芽糖 葡萄糖葡萄糖样品样品酸解液