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1、第五节 微生物原生质体融合技术一、动物多核细胞的发现和原生质体技术的建二、微生物原生质体制备技术三、微生物原生质体融合四、微生物原生质体的其他用途动物多核细胞的发现原生质体融合技术的建立19世纪初，人们发现动物多核细胞现象。 后来研究发现多核动物细胞的产生往往与病毒感染有关。20世纪中叶，人们用病毒诱导离体条件下动物细胞的融合。1838Muller动物病理组织中发现多核细胞1873Lugmbuthl天花病脓胞周围发现多核细胞1896Unna水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞1931Wathin麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞1954Bnders et al组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体1
2、958Marston用副流感病毒诱发细胞融合1970Power et al探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合1972Carlson用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合1972Ferenczy et al以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成1974Michayluk发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合1976Ferenczy et al 以曲霉 青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成1976Fodor et al巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功1977Hopwood链霉菌原生质融合并获融合重组子1978Gleba et al用PEG+高pH-Ca2+研
3、究原生质体融合1981Menczel用高pH-Ca2+9DMSO与少量PEG获得较高的融合率1988Kirimalra et al原生质体融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株PEG原生质体研究的发展原生质体 (protoplast)植物、大多数微生物细胞具有细胞壁。采用一定方法技术去掉细胞壁，剩下的细胞部分称之为原生质体。原生质体融合原生质体融合包括： 原生质体制备、 原生质体纯化 原生质体融合 融合子检出 融合子鉴定超声波处理菌体释放原生质体酶解脱壁释放原生质体 目前多用酶解法微生物原生质体制备放线菌的细胞壁 二氨基庚二酸、甘氨酸、阿拉伯糖、半乳糖 微生物细胞壁的组成细胞壁的组成 微生物种类不
4、同其细胞壁结构和化学组成不同，酶解处理的有效酶也不一样，因此要根据微生物种类特性选择合适的酶。细菌细胞壁的结构 G+ 糖肽、底聚糖、多糖、蛋白质、磷壁酸、糖醛酸磷壁酸、脂多糖 G- 糖肽、磷壁酸、蛋白质、类脂、脂多糖、脂蛋白种类纤维素几丁质其它多糖疫霉属25065毛霉属0944酵母属0160镰刀菌属03929裂褶菌属0581鬼伞属03350真菌的细胞壁成分 自然界中多种生物都能合成破坏降解菌体细胞壁的酶，如蛋清中的溶菌酶，蜗牛消化道中的消化液中酶类，寄生性微生物合成的有关酶。处理细菌细胞壁用酶 溶菌酶Lysozyme处理放线菌细胞壁用酶 Lytic Enzyme裂解酶、 Lysozyme溶菌酶
5、制备微生物原生质体的酶纤维素酶 Cellulase 酵母裂解酶 Zymolyase 1,3葡聚糖酶几丁质酶 Chitinase商品酶 Novozyme234来自 Trichoderma harzianum Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶 Glucuronidase 葡聚糖苷酸酶 (for yeast) 处理真菌用酶酶种类选择 单一酶的组成酶浓度 酶浓度应合适，浓度太高对原生质体有破坏作用，影响原生质体的再生。 lysozyme常用浓度0.10.2 mg/ml glucuronidase 1 lywallzyme 1.5酶解温度 过高的温度会使酶失活，原生质体失活； 过底的温度酶活
6、性不高，影响原生质体细膜稳定性。原生质体释放有关的因素 菌体培养 ： 液体培养 固体培养 收集菌体： 过滤收集 离心收集无菌水冲洗 洗涤菌体： 等渗液冲洗 等渗液与酶液相同 酶解处理： 保温酶解，稀释终止酶解， 离心去酶 过滤分离： 过滤去掉未分解菌丝体 差速离心： 收集大小密度均一的原生质体 低速离心弃沉淀物， 高速离心弃上清液，得纯化原生质体。原生质体制备程序 1融合亲本选育 2原生质体融合操作程序3融合子检出策略4原生质体融合操作程序原生质体的融合 原生质体融合是一随机过程，原生质体间无亲和选择性，当两种原生质体A和B混合到一起时，发生融合的可能性有A-A、A-B、B-B，其中只有只有A
7、-B的融合是有效融合，概率为33.33，当然还会有多个原生质体融合到一起的可能。 此外还存在没参与融合的原生质体仍保留原来性状，要从这个混合体中筛选出A-B型融合子，往往采取相应措施，如亲本菌株的遗传标记。在早期微生物原生质体混合时，多采用原生质体营养缺陷型标记，两者互补恢复野生型的筛选策略，还可以选育抗性菌株等遗传标记。 亲本选择是根据实验目的而确定的，尤其以育种为目标，但要考虑到融合子的筛选。融合亲本选育 亲本的遗传标记 在选择性培养基上选出再生子，使只有A-B型融合子才可能再生出来，而同一种的融合子或未能合的原生质体无法再生。 原生质体灭活 诱变形的遗传标记往往也会使一些有良性状被丧失，
8、对以选育生产性状为目标的育种不能实现。 可以采用灭火原生质体的方法作为检出标记，如采用碘代乙酰胺灭活处理真菌原生质体，使处理后的原生质体失去再生能力，而又对真菌遗传特性无损伤，当两种采用不同灭活剂处理的原生质体融合后，可以完成代谢互补，使融合子恢复再生能力。 荧光染色 在获得原生质体后，分别用不同的荧光素染色亲本原生质体，随后融合，融合后于紫外光显微镜下挑取融合子。（融合子发出两种亲本具有的颜色）融合子检出策略 菌株A 菌株B 液体培养 液体培养 收集菌体 收集菌体 洗涤菌体 洗涤菌体 酶解释放原生质体 酶解释放原生质体 分离纯化原生质体 分离纯化原生质体 AB原生质体等量混合 原生质体融合原
9、生质体融合操作程序 对筛选出的融合子必须进行鉴定，以确定其融合子特性。 细胞结构水平 核相 单核双核 特殊结构形成 PCR 遗传本质 特定基因序列的检出 RAPD 生长发育特性 个体形态特性 目标结构的检出融合子的鉴定 远缘亲本原生质体融合构成的杂和体在遗传体系上存在差异，两套基因组能否协同作用，会导致基因组稳定性问题，两套基因组的共同表达，选择表达也是有待继续研究的问题。 远缘亲本原生质体融合 影响原生质体自身活性的因素 原生质体制备状态 保存条件 再生时的培养条件与操作方法 影响原生质体再生的因子 1. 菌体的生长时期 菌体旺盛生长期长为好 对数生长期。2体预处理 在北京棒壮杆菌处理时加入
10、胺卞青霉素有利与原生质体释放，巴氏梭状芽孢杆菌培养时加1.5乳糖可提高再生率3酶解条件 渗透压稳定剂 Ca+ 、Mg+蔗糖可保持原生质体稳定利于再生 酶解时间 随着酶解时间的增加原生质体的释放量增大 酶解浓度 到达一定浓度后 原生质体的再生率下降 酶解温度 菌体生长温度影响原生质体活性的因素 较低温度可以有效的保持原生质体的活性 细菌 4 48小时 放线菌 4 24小时 真菌 04 保存2天 原生质体贮存条件 细菌易再生 可达90甚至100有些种类也很低， 小单孢菌只有10-3 放线菌 可达50 丝状真菌“产黄青霉”4060 影响原生质体存活的遗传因素 1再生培养基应具备维系、保护又支持和营养
11、的功能2再生培养温度3操作方式 涂布培养法 涂布时对原生质体有损坏4固体培养 一般认为固体培养优于液体培养原生质体再生培养条件 再生培养基应具备维系、保护又支持和营养的功能用MgSO4、甘露醇、山梨糖、蔗糖为渗透剂，不同的微生物种类应选择不同的再生培养基。营养因子，酵母膏、酪蛋白、氨基酸、糖类原生质体保护剂扩张剂的作用牛血清白蛋白、人血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）明胶等对原生质体具有保护作用，同时起到原生质体扩张剂作用，刺激原生质体再生加入再生细胞壁诱导物与前体物质在培养基中加明胶、细胞壁残片甚至纤维素滤膜都有刺激原生质体再生的功能原生质体过高温度对原生质体再生有抑制作用，当再生温度略低
12、于菌株培养温度时，有利于原生质体的再生 再生培养温度涂布培养法 涂布时对原生质体有损坏 双层培养法 将原生质体包埋于半固体琼脂中有利与再生操作方式 固体培养 一般认为固体培养优于液体培养液体培养 时细胞壁可溶性物质很容易扩散（如酵母在液体再生液中很难再生）固体培养基限制有效分子的扩散，但先在液体培养基中预培养23小时有利于提高再生率培养方法对原生质体再生的影响1多细胞菌体的单细胞化作用2真菌双核体单核化作用3菌体脱壁再生优良菌株原生质体4原生质体转化原生质的其他用途 1多细胞菌体的单细胞化作用 许多真菌营养体是多细胞的，当进行诱变处理时，首先应进行单细胞化，采用脱壁形成的原生质体，可以用于诱变
13、处理2真菌双核体单核化作用 许多高等单子菌的次生菌丝是双核体原生质体释放再生过程可以单细胞化，为快速筛选单核体用于育种以及从野生菌人工栽培难以形成子实体制备单核体提供方法原生质的单细胞化作用原生质体具有异质性，脱壁再生的菌株具有很大的差异性，从生长速度、代谢活性上面都表现出差异，通过原生质体释放再生出来的某些食用菌品种可提高产量20，原因 1. 使自发突变显露 2.对菌体细胞刺激作用 菌体脱壁再生筛选优良菌株原生质体更易吸收外源DNA完成转化过程，原生质体作为“感受态”细胞与待转化DNA混合在一定浓度CaCL2DEG作用下进行转化丝壮真菌作为外源基因表达载体具有两个优越性 蛋白质外泌功能 蛋白质合成后的后加工能力同于高等生物 原生质体转化
