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1、Word文档动物细胞/组织培养常见的一些问题 由于影响因素过多,细胞/组织培育中消失的一些问题往往很难分析并得到解决,因此被人戏称为黑色艺术或巫术。本文列举了一些动物细胞/组织培育中常见的问题及解决方法。 1.培育试剂的保存:血清:-5oC - -20oC 保存,避开反复冻融。培育基: 2oC 8oC避光保存。完全培育基: 2oC 8oC避光保存,并在2周内用完。尽量缩短血清和培育基见光的时间2.液体培育基中谷氨酰胺使用方法:许多细胞生长要求在培育液中添加谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置于-20C冰冻保存,用前加入培育基中。加有谷氨酰胺的液体培育基4C 冰箱储存两周以上时,应重新加入原
2、来量的谷氨酰胺。另一种选择是使用L-谷氨酰胺的衍生物 - L-alanyl-L-glutamine dipeptide(如启维益成公司代理的GenDepot的产品Glutaplex配方中含有的成分之一) 替代L-谷氨酰胺。Glutaplex与L-谷氨酰胺相比更加稳定,降解比较慢,提高细胞的存活和生长,极大降低对细胞有毒性的氨的积累。3.培育基中是否应加酚红:酚红在培育基中被用来作为pH值的指示剂,中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时紫色。讨论表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,特殊是雌激素。为避开固醇类反应,培育细胞尤其是哺乳类细胞时,应使用不加酚红的培育基。由于酚红干扰检测,一些讨论人员在做流
3、式细胞检测时不使用加酚红的培育基。 4.使用血清应留意的问题:1)血清第一次使用前,是否应在56oC,30分钟加热血清以灭活补体系统?激活的补体参加溶解细胞大事,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学讨论、培育ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时,推举使用热灭活血清。试验显示,经过正确处理的热灭活血清对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞生长只有微小的促进或完全没有任何作用,甚至通常由于高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率降低。而经过热处理的血清沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观看像是小黑点,经常会让讨论者误以为是血清患病
4、污染。而把血清放在37环境中又会使此沉淀物更增多,使讨论者误认为是微生物的分裂扩增。若非必需,可以不需要做热处理这一步。不但节约时间,更确保血清的质量。2)通常使用的血清的种类:新生牛血清:新诞生牛5天内取血制成。小牛血清:小牛诞生16周以内采血制成。胎牛血清:(进口血清)要求剖腹取胎制成。国内厂家往往不能做到,常常把诞生2天以内采血称为胎牛血清。依据血清的生产工艺及血红蛋白、内毒素含量又分为:(1)特级胎牛血清:40纳米过滤,内毒素含量10EU, 血红蛋白含量10mg/dl。(2)优等胎牛血清:经过3次100纳米过滤,内毒素含量25EU/ml,血红蛋白含量25mg/ml。(3)标准胎牛血清:
5、3次100纳米过滤,低内毒素,低血红蛋白含量。3)为什么储存在冰箱中的胎牛血清会消失沉淀?有些胎牛血清产品没有预老化,储存在2-8时,血清中的各种蛋白和脂蛋白,如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应当不会影响血清的质量。建议在-20储存胎牛血清,避开反复冻融。4)血清解冻后发觉有絮状沉淀物消失:血清中沉淀物的消失有很多种缘由,但最普遍的缘由是由于血清中脂蛋白的变性所造成。而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后也会存在于血清中,也是造成沉淀物的缘由之一。但这些絮状沉淀物并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以400
6、g略微离心,上清液即可接着加入培育基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物,由于它可能会堵塞过滤膜。5)如何避开沉淀物的产生?我们建议您在使用血清的时候,留意下列的操作: (1)解冻血清时,请根据所建议的逐步解冻法(-2至4过夜,37oC水浴解冻)。若血清解冻时转变的温度太大(如-20至37),特别简单产生沉淀物。(2)解冻血清时要随时将之摇摆匀称,使温度及成分均一,削减沉淀的发生。(3)请勿将血清置于37太久。若在37放置太久,血清会变得混浊,同时血清中很多较不稳定的成分也会因此受到损害,而影响血清的质量。(4)假如在高于40oC的水浴中溶化并且不时常摇摆混匀,特别简单造成沉淀物
7、增多。同样血清的热灭活也造成沉淀增多,若非必要,可以省去热灭活。(5)若必需做血清的热灭活,请遵守56,30分钟的原则,并且随时摇摆匀称。温度过高,时间过久或摇摆不匀称,都会造成沉淀物的增多。5.培育用液pH对细胞生长的影响:由于,大多数细胞培育相宜的pH为7.2-7.4,偏离此范围对细胞将产生有害的影响。各种细胞对pH的要求也不完全相同,原代培育细胞一般对pH变动耐受力差,无限细胞系耐受力强。但总体来说,细胞耐酸性比耐碱性强一些,偏酸环境中更利于细胞生长。因此,我们在配制培育用液时,可把液体的pH略微调得偏酸一些。液体在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时,溶液的pH还会向上浮动0.2左
8、右。6.培育基pH变化快速:培育箱中CO2浓度不正确。碳酸氢钠在培育液中浓度范围为2.0 3.7g/L时,CO2的浓度范围应分别为5% - 10%。7.使用培育基时应留意的问题:培育基在使用前需37oC预热。 细胞培育过程中,吸取过培育液的吸管不能再用火焰烧灼,防止残留在吸管内的培育基焦化,将有害物质带入培育液中。尽量缩短各种液体、细胞的暴露时间,削减污染机会。避开液体间、细胞间的交叉污染。配制完全培育基时,配制的量最好在2周内用完为好。8.细胞传代消化时胰蛋白酶的使用问题:培育细胞胰蛋白酶溶液的消化力量和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca+, Mg+离子和血清等因素有关。通常状况
9、下,pH 8.0 , 温度 37 oC 其作用力量最强。另外,钙、镁离子及血清均能大大降低其消化力量。每次进行传代消化前,肯定要用无钙镁离子的PBS液或D-Hanks液反复冲洗细胞培育瓶,以便将含血清的培育基冲洗洁净,这样可大大提高消化液的消化力量。通常使用的消化液浓度为: (1).胰蛋白酶-; (2).胰蛋白酶-。多数细胞传代消化可使用.胰蛋白酶-这种消化液。 第一次开瓶后应马上少量分装于无菌管中,保存于20,避开反复冻融造成胰蛋白酶活性降低,并可削减污染的机会。 留意:假如选用无血清培育基(如启维益成公司代理的TNC Bio公司生产的产品 - 完全无动物成分的血清替代品XerumFreeT
10、M与其他培育基混合配制的无血清培育基),在细胞传代时,不行使用胰蛋白酶消化,由于胰蛋白酶在无血清时可去除细胞膜表面的受体,这种状况应使用AccutaseTM消化。 9.贴壁细胞在用蛋白酶消化时不易分别:1)培育液中存在酶的抑制剂,可使用无钙镁离子的37oC预热的Dulbeccos PBS或胰酶-EDTA洗一遍,再消化2)胰酶浓度太低,使用更高浓度的胰酶,更高浓度的EDTA或不同的酶消化,37oC消化以提高酶活性3)细胞处于铺满状态时间太长,形成细胞间的紧密连接,以后留意在细胞铺满之前进行继代培育。10.细胞分别后形成团块:1) 细胞分散过程太过分,如用力吹吸、酶浓度过高、消化时间过长或温度过高
11、,酶溶液有毒性(如缓冲液pH或渗透压不正确等)以至基因组DNA从裂开的细胞中释放出来。解决方法是在细胞悬液中加入1滴无菌的1mg/ml溶于水中的DNA酶。2)去除上清时,细胞离心的强度太大或时间太长,应使用125g, 10分钟稍微离心。11.悬浮细胞形成团块:1)培育液中含有钙镁离子2)支原体污染3)由于过度消化造成细胞裂解,释放出基因组DNA12.细胞不贴壁:1)消化时间过长,细胞膜上的贴壁蛋白被去除了2)培育基中的血清或贴壁因子(常见于无血清培育基)不足,可在培育基中加入贴壁因子或使用胶原蛋白、多聚L赖氨酸、纤连蛋白等包被的培育瓶。3)支原体污染13.离心动物细胞的离心速率:回收动物细胞,
12、离心速率一般为300g,5 - 10 分钟,离心强度过大将造成细胞裂开死亡。14.细胞生长缓慢:1)换用了不同的培育基或血清,解决方法是可比较不同培育基成分,用生长试验比较以前批次和新批次的血清, 提高接种细胞数,使细胞逐步适应新的培育基 。2)L-谷氨酸等促进细胞生长的成分没加入,用完或分解了。用L-alanyl-L-glutamine dipeptide(如启维益成公司代理的GenDepot的产品Glutaplex)替代L-谷氨酸3)支原体污染或低水平细菌或真菌污染4)培育试剂保存不当5)接种细胞数太少6)细胞传代次数太多7)细胞传代时密度太高,应在细胞铺满前的指数生长期传代15.细胞死亡
13、:1)培育箱中无CO2,检查管子有无泄漏,是否需更换CO2罐,尽量削减开关培育箱的次数2)培育箱温度不恒定3)抗真菌剂或抗生素浓度过高,对细胞产生毒性4)细胞在冻存或解冻过程中被破坏5)培育基中渗透压不正确6)培育基中积累了有毒的代谢产物16.细胞冷冻培育基的成份:动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培育基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 %原来细胞生长用的新奇培育基匀称混合。留意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能,所以不行将DMSO 直接加入细胞液中,必需使用前先行配制完成。17.DMSO的等级及使用和保存: 冷冻保存使用之DMSO 等级
14、必需为Tissue culture grade的DMSO (如Sigma D2650)。其本身即为无菌状况,第一次开瓶后应马上少量分装于无菌试管中,保存于4C。避开反复冻融造成DMSO 裂解而释出有害物质,并可削减污染的机会。若要过滤DMSO,则须使用耐DMSO 的Nylon 材质滤膜。 18.冻存液中的甘油的保存:要避光保存,见光后甘油转化为对细胞有毒性的丙烯醛。19.细胞欲冷冻保存时留意事项:冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml,融合瘤细胞则以5x106 cells/ml为宜。实际操作时,建议根据细胞生产商建议的细胞密度冻存。冻存传代次数低的细胞。20.冷冻保存细胞之方法:冷
15、冻保存方法一: 冷冻管置于4 30-60 分钟 (-20 30 分钟) -8016-18 小时(或隔夜) 液氮槽vaporphase长期储存,如细胞浸在液氮中,有可能被液氮中的微生物污染。冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降1-3 至80 以下,再放入液氮槽vapor phase长期储存。-20不行超过1小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡。也可跳过此步骤直接放入-80 冰箱中,但存活率降低。21.细胞解冻:快速解冻,将37oC预热的培育基逐滴加入解冻的细胞。22.支原体污染、检测及处理:支原体污染在细胞培育中最常见、不易被查觉,但支原体污染可显著影响细胞功能干扰试验结果。支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能单独生活的最小微生物,它无细胞壁,形态呈高度多形性,最小直径0.2um,可通过滤器。课题组从国外引进细胞株/系也常常消失支原体的污染。支原体在污染细胞后,它通过影响细胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培育基中的氨基酸来抑制细胞的生长,并能降低细胞的融合率。因此,在运用各种细胞系进行试验讨论时,首先要证明所用细胞有无支原体的污染。支原体污染后,培育基可不发生浑浊,细胞病变稍微或不明显,因此难以发觉。目前,支原体检测的方法有以下几种。(a)相差显微镜观看;(b)低张处理地衣红染色法; (c)荧光