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1、Word文档水体中大肠菌群的检测步骤试验原理 所谓大肠菌群，是指在37培育24h 内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革蓝氏阴性无芽孢杆菌的总称。主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。 水的大肠菌群数是指100 mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。在正常状况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽孢杆菌等多种细菌。这些细菌都可以随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群是粪便污染的指标。因而对饮用水必需
2、进行大肠菌群的检查。 水中大肠菌群的检测方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可适用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要的时间较长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简洁、快速，但不适用于杂质较多、易于堵塞滤孔的水样。 材料与器皿 ()培育基 1、一般乳糖蛋白胨培育液 蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，乳糖5g，氯化钠 5g，1.6%溴甲酚紫乙醇液 1.0mL，蒸馏水 1000mL，pH 7.27.4。 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调整pH为7.27.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混匀，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管10mL，115灭菌20mi
3、n。 2、三倍浓缩乳糖蛋白胨培育液 按上述一般乳糖蛋白胨培育液浓缩三倍配制，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管5mL。 3、品红亚硫酸钠培育基(供平板分别用) 蛋白胨 10g， 乳糖 10g，K2HPO4 3.5g，琼脂 15-20g，蒸馏水1000mL，无水亚硫酸钠 5g，5%的碱性品红乙醇溶液 20mL，pH 7.27.4。 4、伊红美蓝培育基(EMB培育基)(供发酵法平板分别用，3和4可任选一种) 蛋白胨10g，乳糖10g，K2HPO4 2.0g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，2%伊红(曙红)水溶液 20mL，5%美蓝(亚甲蓝)水溶液13mL，pH 7.27.4。 (二)灭菌移液管、灭菌
4、稀释水、试管、杜汉氏小管、革兰氏染色液、灭菌培育皿。 试验过程 (一)水样的采集 供细菌学检验的水样，必需按一般无菌操作的基本要求采集，并保证再运输、贮存过程中不受污染。水样从采集到检验不应超过4h ，在0-4下保存不应超过24h ，如不能在4h内分析，应在检验报告上注明保存时间和条件。 1、自来水取样：应在水龙头打开放水5min，再用无菌容器接取水样，待分析。如水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3% Na2S2O3.5H2O溶液1mL。 2、江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。采样后，瓶内应留有空隙。假如与其他化验项目联合取样，细菌学分析水样应采在其他样品
5、之前。 (二)初发酵试验 1、水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，方法为用无菌移液管吸取水样10mL放于盛有90mL无菌水和若干玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡使混合匀称，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液;再从10-1制备10-2稀释液。以此类推，稀释到所需倍数。 2、接种和培育：以无菌操作于5支三倍浓缩培育基(接种前肯定应先检查杜汉氏小管内有无气泡)中各加入水样10mL，5支一般培育基试管中加入水样1mL，5支一般培育基试管中加入10-1稀释液1mL，当心混匀放入37培育箱中培育24h。此即5管法。 3、结果观看：37中培育24h后取出观看，观看有无气体(杜汉氏小管内有无
6、气体)和酸产生(培育基有无变色)。在48h之间，培育管内倒置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累，或培育基颜色从紫色变为黄色，便可初步断定为阳性反应。 若试验所测定的15支管中均为阳性反应，说明浓水样污染严峻，可将样品进一步稀释后，再按上述方法接种、培育和观看。 (三)平板培育试验 将初发酵试验中产酸产气的后只产酸或只产气的试管中的培育物用接种环取少许，划线接种在品红亚硫酸钠培育基或伊红美蓝培育基平板上，为了确保获得分别的单菌落，须留意以下事项： (1)划线间距至少相隔0.5厘米; (2)接种钉尖端要稍弯; (3)先对试管轻击并使之倾斜，以免接种针挑取到任何膜状物或浮渣; (4)划线时要用针尖的弯
7、曲部分接触琼脂培育基平面.以免刮伤或戳破培育基。划线后培育皿倒置，于37培育18-24h。 24h后，观看在平板上消失的单个菌落，其核心有深绿色金属光泽者为较典型的大肠菌群菌落。尽可能挑取典型的或接近典型的大肠菌群菌落，在养分琼脂斜面上划线，置37培育24h。挑取斜面培育物制成涂片，进行革兰氏染色，凡属革兰氏阴性杆菌，即确认了大肠菌群细菌的存在. (四)复发酵验证明验 经上述经染色为革兰氏阴性的典型菌落，用接种环刮取部分接种于盛有乳糖培育基的试管中，在37培育24h，阳性反应者即确认为大肠菌群细菌。 结果计算 在初发酵试验中，可能有极少数能发酵乳糖产气的非大肠菌群细菌混在阳性可疑反应管中，通过对初发酵中的阳性可疑管进行平板和复发酵试验，并进行革兰氏染色和细菌形态的观看，可将那些少量的非大肠菌群细菌(假阳性管)删除去，故在记录时只能把三步试验都呈阳性的试管计入阳性反应管。 假如初发酵接种水样量为10mL、1mL、0.1mL，可直接查表求出原水样100mL中大肠菌群指数(MPN)。假如接种水样量低于上述水样量，则经下面的换算式计算。 5
