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1、微生物学通报Microbiologytongbaoim.ac SEP 20, 2009, 36(9): 13181323 2009 by Institute of Microbiology, CAS一株DMP 降解菌的分离鉴定及其降解特性金德才 吴学玲*梁任星 代沁芸 王洋洋 杨宇(中南大学资源加工与生物工程学院湖南 长沙410083)摘要: 从山东省潍坊市污染河流底泥中筛选到 1 株能够以酞酸酯(Phthalic acid esters, PAEs)为唯一碳源和能源生长的微生物, 命名为 JDC-3, 根据形态学观察、生理生化指标测定和分子生物学鉴 定结果, 将该菌株初步鉴定为戴尔福特菌属(
2、Delftia sp.), 以一对简并引物, 首次在该属中扩增出 编码邻苯二甲酸双加氧酶的基因片段。同时以邻苯二甲酸二甲酯(Dimethyl phthalate, DMP)为目标 测试物, 利用高效液相色谱(HPLC)测定了 JDC-3 的降解性能, 得出该菌对 DMP 降解的最佳条件为: pH 7.08.0、温度 30C35C; 在不同 DMP 初始浓度下研究了该菌的降解动力学, 结果表明当浓 度低于 300 mg/L 时的降解动力学方程为 ln C = 0.06837 t + A, 半衰期为 12.48 h, 当初始浓度不 断增加, DMP 对 JDC-3 的抑制能力增强, JDC-3 对
3、 DMP 的降解速率不断下降, 半衰期增大。 关键词: 邻苯二甲酸二甲酯, 16S rDNA, 高效液相色谱, 降解动力学Isolation, Identification and Degradation Characteristicsof a DMP-degrading StrainJIN De-CaiWU Xue-Ling*LIANG Ren-XingDAI Qin-YunWANG Yang-YangYANG Yu(School of Minerals Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha, Hu
4、nan 410083, China)Abstract: A bacterial strain which could grow well on the substrate of PAEs as the sole source of carbonand energy was isolated from contaminated sludge in the river of WeiFang in ShangDong province and it was designated as JDC-3. Based on the morphology, biophysical and biochemica
5、l properties as well as mo- lecular characteristics, this isolate was preliminarily identified as Delftia sp. A fragment of phthalate dioxy- genase gene was successfully amplified from the genus of Delftia for the first time using a set of degenerate primers. Meanwhile, the degradation capability of
6、 JDC-3 was determined by HPLC using DMP as test sub- strate. The results showed that the optimal pH and temperature were at 7.08.0 and 30C35C respectively. The degradation kinetics of JDC-3 was studied in different initial DMP concentration under optimal condi- tions. The results indicated that the
7、degradation dynamic equation was ln C = 0.06837 t + A when DMP concentration was lower than 300 mg/L, with half life of 12.48 h. The degradation rate decreased and half life of JDC-3 prolonged as the initial concentration kept on increasing.Keywords: DMP, 16S rDNA, HPLC, Degradation kinetics基金项目：国家自
8、然科学基金项目(No. 30770388)* 通讯 Tel: 86-731-8804873;: xueling0714yahoo 收稿日期：2008-12-17; 接受日期：2009-03-20邻苯二甲酸酯 (Phthalic acid esters, PAEs), 又名酞酸酯, 是目前世界上生产量大、应用面广的人 工合成有机化合物, 特别是在塑料工业中得到广泛应用。随着塑料工业的快速发展及塑料产品的广泛应用, PAEs 已普遍存在于大气, 土壤, 水体中, 成为 无处不在的污染物1。国外已称它们为“第二个全球性的 PCB 污染物”。已有研究表明, PAEs 作为环 境雌激素的典型代表, 能通
9、过食物链在生物体内逐渐富集, 且可转移到下一代, 具有致癌、致畸、破坏 免疫和生殖功能等毒性2, 引起了各国的普遍关注。美国环境保护署 (EPA)和中国环境监测总站已先后 将该类化合物列为优先控制的污染物3,4。由于邻苯二甲酸酯的水解和光解非常缓慢, 微生物降解是自 然环境中邻苯二甲酸酯完全矿化的主要途径5。目前 分离到的邻 苯二甲酸酯 降解菌有 Pseudomonassp.6、Bacillus sp.7、Burkholderia sp.8、Rhodococcus rubber9 等 。而 关于利用戴 尔福特菌属 (Delftia sp.)降解 PAEs 的报道只有 1 篇, 本实验室分离到一
10、株邻苯二甲酸酯降解菌 JDC-3, 经初步鉴定为戴尔福特 菌属(Delftia sp.)的细菌, 并首次在该菌中克隆出编码邻苯二甲酸酯双加氧酶的基因片段。另外, 在最30 min。固体培养基每 1 L 加入 20 g 琼脂。1.2菌株富集、分离与纯化土样为山东省潍坊市污染河流底泥。从样品中 称 10 mg 的污泥于 含 20 0 mg / L 邻苯二甲酸酯 (DMP、DEP、DBP、DOP 各为 50 mg/L)的 100 mL无机盐培养液中, 采用梯度压力法驯化, 30C 振荡培养 7 d, 逐 步转接 至含 240 m g / L 、 2 80 m g / L 、320 mg/L、360
11、mg/L、400 mg/L 邻苯二甲酸酯的无机盐培养液后, 用接种针蘸取少量菌液, 在 PAEs 固 体平板上划线, 选择菌落较大、形态和颜色各异的菌落转接到新的固体培养基上划线, 重复 5 次后,挑取单菌落重新接到富集培养基中培养。l.3细菌生理生化特性测定生理生化鉴定参考文献10,11进行。细菌的 16S rDNA 的扩增和系统发育树的构建16S rDNA 扩增和序列测定: 正向引物(FC27)为:1.45-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3;反 向 引 物(RC1492)为: 5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。50 L 反应体系中 10PCR buffer
12、5 L, 10 mmol/LdNTPs 1 L, 25 mmol/L MgCl2 4 L, 5 U/L Taq 酶0.5 L, 5 pmol/L 引物各 1 L, DNA 模板 4 L, 加ddH2O 补齐 50 L, 扩增程序: 95C 5 min; 94C 45 s,55C 1 min, 72C 1 min, 30 个循环; 72C 10 min。取 全部反应液进行琼脂糖凝胶电泳。用 E.Z.N.A.TM GelExtraction Kit (Omega)进行胶回收, PCR 纯化产物的测序工作由上海生工公司完成。用 Clustal X1.8 软件 进行全序列比对, 并用 Mega 4 构
13、建系统发育树。1.5 细菌邻苯二甲酸双加氧酶的扩增及其分析参考 Chao 等12的简并引物进行细菌邻苯二甲酸双加氧酶基因的 PCR 扩增, 正向引物: 5- ACACS CCBCARACSCACAC-3; 反向 引 物 : 5-CTTGTCC TGCTACAGCTCTTG-3。扩增体系如下: 50 L 扩增体系为 10PCR buffer 5 L, 2.5 mmol/L MgCl2 4 L,10 mmol/L dNTPs 4 L, 3端和 5端引物各 1 L, Taqpolymerase 0.5 L, DNA 模板 100 ng 左右, 加 ddH2O至 50 L, PCR 反应条件: 95C
14、 10 min; 94C 1 min,56C 1 min, 72C 1 min, 35 个循环; 72C 10 min。电 泳回收 PCR 产物, 将回收纯化的 DNA 和 PGM-T 载体相连接, 4C 过夜。将连接产物转化到大肠杆菌DH5 感受态中, 涂布到含有氨苄青霉素(50 g/mL) 琼脂 LB 平板上进行蓝白筛选, 挑白斑做菌落 PCR 确 定, 将阳性克隆子送至上海生工测序, 测序所得序列适降解条件下, 在不同的底物浓度下,解动力学做了初步分析。对该菌的降1 材料和方法1.1 主要试剂和培养基邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯
15、二甲酸二辛 酯(DOP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DIOP)购自中国医药集团上海化学试剂公司 , 含量 99.5%, 甲醇 (分析 纯)和乙酸乙酯(分析纯)由天津市大茂化学试剂厂生 产, 色谱级甲醇购自美国 Sigma 公司。无机盐培养基(g/L): K2HPO4 5.8, KH2PO4 4.5,(NH4)2SO4 2.0, MgCl2 0.16, CaCl2 0.02, Na2MoO42H2O 0.0024, FeCl3 0.0018, MnCl2 2H2O 0.0015, pH调至 7.0, 1105 Pa 灭菌 20 min。固体培养基每 1 L加入 20 g 琼脂。DMP 无机盐培养液: 以正己烷配制 10 g/L 的DMP 溶液, 取一定量的 DMP 溶液, 置于灭菌的三 角瓶中, 待正己烷挥完毕加入灭菌的无机盐基础培 养液。富集培养基 (g/L): 牛肉膏
