分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*2781 分子标记辅助选择育种主讲人：洪德林 教授 南京农业大学农学院 2014年8月25日南京 ，分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*2782内容：一、分子标记辅助选择的含义和意义二、分子标记的类型三、重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术四、作物MAS育种分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*2783一、分子标记辅助选择的含义和意义选择是指从一个育种群体中挑出符合要求的目标基因型传统育种是通过目标性状的表现型对基因型进行间接选择分子标记辅助选择（Marker-assisted selection, MAS) 是利用与目标性状基因紧密连锁的标记对基因型进行间接选择分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*2784传统育种主要依赖对植株的表现型选择（phenotypic selection）环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*2785例如抗病性的鉴定就受发病条件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、鉴定工作就更困难。
一个优良品种的培育往往需花费78年甚至十几年时间如何提高选择效率，是育种工作的关键 分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*2786育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的紫色叶鞘等形态性状标记，在育种工作中曾得到一定的应用分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*2787 以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外源基因鉴定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*2788 生化标记主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异，已在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用但是它们多态性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传育种工作需要分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*2789以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析、品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection, MAS)育种更受到人们的重视。
分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27810与传统的表现型选择相比，MAS的优点： 1、不受等位基因间显隐性关系、其他基因效应和环境因素的影响，选择结果可靠分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*278112、可在植株生长发育前期和育种早代时期进行选择，提高选择效率和缩短育种年限意义：省钱省时）分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27812（一）分子标记辅助选择的基本原理 首先，通过基因定位或QTL分析，获得与目标性状基因或QTL连锁的分子标记什么是遗传标记？）分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27813200bp300bp100bp110bp120bp图1 引物RM5629对5个杂交组合F1及其亲本的扩增带型1=863A ；2=863B；3=86优8 ；4=宁恢8号, 5=9522A；6=9522B；7=常优1号；8=R254；9=六千辛A ；10=六千辛B；11=六优一号；12=77302-1；13=泗稻8号A；14=泗稻8号B ；15=泗优422；16=LH422；17=03A；18=03B；19=3优18；20=C418. M：梯度为100 bp的DNA大小标记分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27814200bp195bp180bp100bp300bp100bp200bp100bp300bp200bp100bp200bp300bp图1 用SSR引物JESPR-110，扩增棉花P1、P2、F1及158个BC1F1单株总DNA的PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图注：M为100 bp ladder 的Marker，P1为T586，P2为T582。
分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27815分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27816 办法是：通过构建包含目标性状分离群体（F2群体、BC1F1群体、DH群体或RIL群体、BIL群体）和连锁分析，获得与目标性状基因连锁的共显性分子标记分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27817 基于PCR 技术的分子标记，如SSR标记、SCAR标记、CAPS标记、STS标记等，是较理想的适用于辅助选择的分子标记分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*278182. 分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27819（分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*278202. 分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*278212. 分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*278222. 分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*278232. 分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27824 然后，利用分子标记对目标基因型进行辅助选择。
这是通过对分子标记基因型的检测间接选择目标基因型 分子标记与目标基因的连锁越紧密，选择效率越高分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27825 有研究表明，若要选择效率达90%以上，则标记与目标基因间的重组率必须小于0.05 同时用两侧相邻的两个标记对对目标基因进行选择,可大大提高选择的准确性分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27826 在回交育种程序中，除了对目标基因进行正向选择（前景选择）外，还可同时对轮回亲本的遗传背景进行选择（背景选择）分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27827分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27828（二）不同目标性状类型的分子标记辅助选择效率 对于质量性状： 在多数情况下，没有必要借助分子标记辅助但在以下几种情况下，利用标记辅助选择可提高选择效率分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27829表现型测定在技术上难度较大或费用很高，如抗病虫性举例：玉米矮缩病，病毒不能通过卵子传递，抗病鉴定难度大分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27830分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27831分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27832表现型只在个体发育后期才能测量。
如籽粒蛋白含量分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27833目标性状由隐性基因控制，在杂合世代不表现回交转育过程中，还需同时对背景进行选择分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27834对于多基因控制的数量性状： 对多基因选择不但技术上更复杂，成本更高，而且由于每个QTL的贡献率较小，效率也更低分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27835 尽管如此，一旦建立起QTL与分子标记的连锁关系，就有希望利用MAS进行改良分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27836借助分子标记对QTL进行辅助选择的成败主要取决于对QTL的精确定位以及QTL受环境因素和其他基因型影响的大小分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27837 目前对QTL的分析在相当大的程度上还是建立在样本较小、实验精确性较低、统计分析未考虑上位性效应的基础上，仍需完善方法及其应用软件，从而更精确地估计QTL对表现型的贡献率分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27838二、 分子标记的类型分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27839按技术特性，分子标记可分为四大类。
第一类是以DNA分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记（restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记） （第一代，20世纪70年代发现，1980用于构建人类连锁图） 分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*278401RFLP标记的原理 植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶（restriction enzymes，RE）酶切位点的增加或丧失是产生限制性片段长度多态性的原因分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27841对每一个DNA/RE组合而言，所产生的片段是特异性的，它可作为某一DNA所特有的“指纹”分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27842某一生物基因组DNA经限制性内切酶消化后，能产生数百万条DNA片段，通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27843用放射性同位素（如P32）或非放射性物质（如生物素、地高辛等）标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交（即Southern杂交）。
若某一位置上的DNA酶切片段与探针序列相似，或者说同源程度较高，则标记好的探针就结合在这个位置上分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27844放射自显影或酶学检测后，即可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况（图17-2）分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27845图17-2 RFLP分析流程图 分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27846 对于线粒体和叶绿体等相对较小的DNA分子，通过合适的限制性内切酶酶切，电泳分析后有可能直接检测出DNA片段的差异，就不需Southern杂交分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27847RFLP分析的探针，必须是单拷贝或寡拷贝的，否则，杂交结果不能显示清晰可辩的带型，表现为弥散状，不易进行观察分析RFLP探针主要有三种来源，即cDNA克隆，植物基因组克隆（random genome克隆，简称RG克隆）和PCR克隆 分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*278482RFLP标记的特点 RFLP标记具有共显性的特点共显性（co-dominant）标记指的是来源于双亲的同一基因位点产生两个以上分子量不同的多态性片段，均在F1中表现。
它已被广泛用于多种生物的遗传分析，特别是构建植物遗传图谱分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27849RFLP标记所需DNA量大（515ug），检测步骤比较繁琐，需要的仪器、设备较多，周期长，检测少数几个探针时成本较高，用作探针的DNA克隆其制备与存放较麻烦；检测中要利用放射性同位素（通常为P32），易造成污染分子标记辅助选择育种-作物商业化育种体系与育种技术培训班*27850尽管非放射性物质标记方法可用，但价格高，杂交信号相对较弱，灵敏度也较同位素标记低目前，RFLP标记直接用于育种成本高，人们一直致力于将RFLP标记转化为PCR标记，便于在育种上利用 分子标记辅助选择育种-作物。