肿瘤相关巨噬细胞促进上皮性卵巢癌迁移的机制研究上皮性卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤,由于其发病隐匿、进展迅速、缺乏特异性的早期症状和检查方法,超过70%的患者诊断时已发生盆腹腔广泛转移而处于晚期[1]卵巢癌的转移是造成卵巢癌高死亡率的重要因素之一,其形式以腹腔散播为主,细胞通过直接蔓延,或经过腹水漂移到盆腹腔腹膜表面而形成广泛种植[2]卵巢癌转移微环境中发现的基质细胞包括成纤维细胞、脂肪细胞、间皮细胞和免疫细胞,其中巨噬细胞是最丰富的免疫细胞类型巨噬细胞根据其个体定位、所处微环境的不同,可呈现有差异的表型和功能,主要分为两大类:一类是经典激活的巨噬细胞M1型,一类是选择性激活的巨噬细胞M2型,其中M2型为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages,TAMs)[3]TAMs是被认为兼有免疫调节和创伤修复的功能群体,其在肿瘤发展过程中主要发挥着促进肿瘤转移的作用[4]本研究探索了TAMs对上皮性卵巢癌细胞生物学行为的影响及其可能的调控机制,为抑制上皮性卵巢癌迁移和侵袭提供新的治疗靶点1、材料1.1细胞系人卵巢癌SK-OV-3细胞、人卵巢癌OVCAR-3细胞[美国典型培养物保藏中心(ATCC)]。
1.2试药及仪器巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF,PEPROTECH,批号:315-02);白细胞介素-4(IL-4,PEPROTECH,批号:214-14);抗E-Cadherin单克隆抗体(批号:3195)、抗N-Cadherin单克隆抗体(批号:13116)、抗Vimentin单克隆抗体(批号:5741)、抗黏着斑激酶单克隆抗体(批号:13009)(CellSignalingTechnology);抗β-actin单克隆抗体(SANTACURZ,批号:sc-69879);抗基质金属蛋白酶(MMP)-2单克隆抗体(批号:66366-1-AP)、抗MMP-9多克隆抗体(批号:10375-2-AP)(Proteintech)Matrigel胶(BDFalcon,USA);Transwell小室(COSTAR,货号3412,6孔,孔径0.4μm);Transwell小室(COSTAR,货号3421,24孔,孔径5.0μm)AmershamImager600化学发光成像仪(美国GE);LightCycler®96实时荧光定量PCR仪(Roche);流式细胞仪(BDFACSCantoⅡFlowCytometer);Centrifuge5702台式常温低速离心机(Germany,Eppendorf公司);NanoDrop2000核酸蛋白测定仪(Thermo公司);培养基DMEM/F-12(Gibco,C11330500BT);RPMI-1640培养基(BI,CA,USA)。
1.3动物BALB/C小鼠(6～9周),雄性,体质量25g左右,动物使用许可证号:SYXK(津)2016-00012,饲养于天津医科大学SPF级动物中心2、方法2.1TAMs诱导鉴定小鼠颈椎脱臼处死,取双侧胫骨和腓骨骨髓,将小鼠骨髓细胞接种至平皿,细胞培养基DMEM/F-12中添加M-CSF(50ng·mL-1)进行培养,提取的细胞从第2日开始贴壁生长,逐渐分化为巨噬细胞,F4/80和CD11b表面标志增加;然后加入细胞因子IL-4(10ng·mL-1)进行刺激,诱导分化获得TAMs,使用CD206和CD11c标志物,采用流式细胞术对所得细胞进行鉴定[5,6],仅使用M-SCF进行诱导的细胞经过鉴定为F4/80和CD11b双阳性(见图1A),所得细胞继续使用IL-4进行诱导后鉴定结果为F4/80+CD11b+CD206+CD11c-(见图1B),此细胞可用于后续研究使用2.2利用Transwell小室建立细胞共培养系统图1流式细胞术检测TAMs取生长状态良好的卵巢癌细胞(SK-OV-3和OVCAR-3细胞),分别制成单细胞悬液,调整细胞密度为6×105个·mL-1,在6孔板中每孔接种0.5mL,最后补足RPMI-1640培养基至3mL。
利用微孔孔径0.4μmTranswell小室建立非接触式的细胞共培养系统,取TAMs制成细胞密度为2×106个·mL-1的单细胞悬液,每孔约0.3mL接种于Transwell上室内底面,补足培养基至2mL然后将小室置于接种有卵巢癌细胞的孔内继续培养48h2.3划痕愈合实验使用与TAMs共培养后的卵巢癌细胞进行划痕愈合实验,先在6孔板中每孔加入约5×105个细胞,第2日,卵巢癌细胞过夜后融合率达到100%时用枪头比着直尺划痕用PBS洗涤细胞3次,去除未贴壁的细胞,加入无血清培养基将细胞置入37℃,含5%CO2培养箱继续培养,根据细胞迁移速度选择不同时间点拍照使用ImageJ软件随机选取6～8条水平线,计算细胞间距离的均值2.4Transwell小室观察迁移和侵袭能力2.4.1迁移实验将SK-OV-3和OVCAR-3细胞与TAMs共同培养48h,然后将SK-OV-3和OVCAR-3细胞制成单细胞悬液,细胞密度为5×105个·mL-1,每孔约100μL接种于微孔孔径5.0μm的Transwell小室内底面,上室用无血清的培养基;下室放置含有10%FBS的培养基2mL,在相应时间点观察细胞穿过微孔的个数,以此来计算细胞的迁移率。
设置不加TAMs的空白组2.4.2侵袭实验细胞处理与“2.4.1”项下相同,不同之处在于将Matrigel胶提前置于4℃使其变为液态,然后用冰的PBS按1∶4比例稀释混匀并包被Transwell小室,每个小室内加入40μLMatrigel溶液,37℃凝固后使用设置不加TAMs的空白组2.5实时荧光定量PCR(qRT-PCR)使用异丙醇沉淀法提取与TAMs共培养后的卵巢癌细胞的总RNA,进行逆转录,用实时荧光定量PCR进行检测PCR反应程序:95℃预变性10min,每个循环95℃变性10s,60℃退火延伸30s,一共45个循环利用LightCycler®96软件分析实验结果2.6免疫印迹实验(Westernblot)使用RIPA裂解液提取与TAMs共培养后的卵巢癌细胞蛋白,所有蛋白样品调至等浓度后上样,上样量为40μg,实验过程中将膜放置于相应的一抗中,4℃孵育过夜第2日将膜取出,洗涤后将膜放置于辣根过氧化物酶标记二抗中,室温孵育1h后显色并进行拍照2.7统计学方法采用两组独立样本t检验,结果P<0.05为差异有统计学意义3、结果3.1TAMs对卵巢癌细胞迁移的影响此次研究分为空白组和TAMs刺激组,划痕结果显示,经过TAMs刺激后,卵巢癌细胞SK-OV-3和OVCAR-3迁移能力较空白组显著增强。
根据两种不同卵巢癌细胞的生长速度确定划痕愈合实验中不同的观察时间点,SK-OV-3细胞观察3个时间点(0h、12h和26h),经TAMs刺激的SK-OV-3细胞在12h和26h都可以观察到迁移速度加快;OVCAR-3细胞选择的3个时间点为0h、18h和30h,经TAMs刺激的OVCAR-3细胞系在18h和30h可以观察到迁移速度加快(见图2)图2划痕愈合实验检测TAMs刺激对卵巢癌细胞SK-OV-3和OVCAR-3迁移能力的影响3.2TAMs促进卵巢癌细胞迁移和侵袭Transwell迁移和侵袭实验结果显示,TAMs刺激后,SK-OV-3和OVCAR-3细胞的穿膜细胞数显著增加SK-OV-3和OVCAR-3细胞与TAMs共培养后其迁移和侵袭能力增强结果表明,TAMs可显著增强卵巢癌细胞的体外迁移和侵袭能力(见图3)3.3TAMs对卵巢癌细胞发生上皮间质转化(EMT)的影响图3Transwell实验检测TAMs对卵巢癌细胞SK-OV-3和OVCAR-3迁移和侵袭行为的影响实验结果显示,与空白组比较,经TAMs刺激后,SK-OV-3和OVCAR-3细胞的E-cadherin的表达量降低,N-cadherin和波形蛋白(Vimentin)的表达量有明显提高。
qRT-PCR的结果与Westernblot法检测的结果一致,提示TAMs可诱导卵巢癌细胞发生EMT变化(见图4)图4qRT-PCR(A、B)和Westernblot法(C)检测TAMs对卵巢癌细胞EMT的影响3.4TAMs对卵巢癌细胞系FAK及MMPs家族的表达调控作用利用Westernblot分别检测空白组和TAMs刺激组SK-OV-3和OVCAR-3细胞的FAK、MMP-2和MMP-9蛋白量的变化,结果提示SK-OV-3和OVCAR-3细胞的FAK、MMP-2和MMP-9表达显著上调,与空白组相比,差异有统计学意义(见图5)提示TAMs促进卵巢癌细胞恶性病变可能是通过上调其FAK、MMP-2和MMP-9的表达实现的图5TAMs上调卵巢癌细胞FAK、MMP-2和MMP-9的表达4、讨论肿瘤微环境在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用,巨噬细胞是肿瘤微环境中炎性细胞的主要成分存活的瘤细胞到达靶器官后,通过其黏附作用在毛细血管着床,进而穿透血管侵入周围组织形成转移灶[7]在此过程中,肿瘤细胞的黏附能力和侵袭能力发挥着重要作用本次研究结果提示M2型的TAMs促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭因此,研究TAMs影响卵巢癌细胞的作用机制对于研究卵巢癌的发生发展规律及指导其临床预后具有非常重要的意义。
EMT是癌细胞转移过程中的重要步骤,涉及细胞表型从上皮形态到间充质形态的变化,在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中发挥重要作用其主要分子学特点是上皮性表型标志物如细胞黏附分子E-cadherin表达下调,N-cadherin表达上调,细胞角蛋白细胞骨架转化为Vimentin为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等[8]本次研究通过qRT-PCR、Westernblot法检测TAMs共培养的卵巢癌细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的变化,发现E-cadherin蛋白表达量降低、N-cadherin和Vimentin蛋白表达量均升高,EMT表型发生变化,提示卵巢癌细胞经过TAMs刺激后,细胞间黏附变差,侵袭能力增强,由此推测TAMs可通过改变卵巢癌细胞的生物学行为,从而促进卵巢癌的发生发展EMT作为整合素信号通路中的关键性调节分子,在肿瘤细胞多个信号转导过程中发挥重要作用,其主要功能是将细胞外的信号经整合素及生长因子受体途径传导至细胞内[9]近些年的研究表明,FAK的过度表达或活性增强与恶性肿瘤的多种生物学行为密切相关,如癌症发生、增殖、迁移、侵袭和抵抗凋亡等[10,11]。
本研究中与TAMs共培养的卵巢癌细胞的FAK的表达量明显增加,为FAK参与包括卵巢癌在内的多种肿瘤的发生发展提供了有力的证据MMPs是一组结构功能相关的锌离子依赖性内肽酶,是降解细胞外基质的主要酶类,并且可降解形成基质及基底膜的所有胶原,蛋白多糖及层粘连蛋白等成分,可能是肿瘤转移和浸润的主要因素[12,13]主要包括MMP-2和MMP-9,MMP-2的表达与卵巢癌的进展显著相关,在卵巢癌腹腔转移灶中发现MMP-2表达的增加与卵巢癌患者死亡危险性的上升有很大关系[14]Furuya等[15]研究发现黏液性和浆液性卵巢癌的囊液中MMP-2的表达水平较良性和交界性卵巢肿瘤囊液明显增多MMP-9能够优先降解基底膜中的Ⅳ型胶原蛋白,此种降解在恶性肿瘤迁移及侵袭中发挥着重要的作用Wang等[16]利用Westernblot、RT-PCR以及免疫组织化学等实验发现血小板源生长因子D通过上调MMP-9的表达促进卵巢癌的迁移和侵袭本研究结果显示:经过TAMs刺激后的卵巢癌细胞的MMP-2和MMP-9的蛋白表达量明显增加,促进卵巢癌细胞迁移。