电力泰安樱桃根癌病致病菌分离与生物型鉴定研究由致病性土壤杆菌Agrobacteriumspp.侵染植物引起的根癌病,是严重的细菌性病害之一,其寄主范围达百余科上千种植物在核果类、浆果类、坚果类果树和其他观赏植物中最易发生[1]主要危害植物根茎、侧根和枝干部位,典型症状是在受害植株的根部、根茎处甚至茎上形成大小不一的瘤状组织使植株发育受阻,影响果树苗木的生长土壤杆菌Agrobacteriumspp.,属于细菌域,细菌界,变形细菌门,α变形菌纲,根细菌目,根瘤菌科,土壤杆菌属;是革兰氏阴性细菌对于它的分类,目前存在以致病性和以生理生化特性为依据的两种不同方案现在普遍接受的是分为4个致病型种类和1个非致病型:原生物Ⅰ型根癌土壤杆菌A.tumefaciens、原生物Ⅱ型发根土壤杆菌A.rhizogenes、原生物Ⅲ型葡萄土壤杆菌A.vitis和悬钩子土壤杆菌A.rubi,以及非致病性的放射土壤杆菌A.radiobacter[2]根据侵染植株形成肿瘤中冠瘿碱的种类,土壤杆菌又可分为章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型(agropine)、琥珀碱型或农杆菌素碱型(agrocinopine)等[3],其中以章鱼碱型和胭脂碱型最为常见。
目前国内外对土壤杆菌的致病机理[4]研究较多,对根癌病的防治以生物防治为主,并且已筛选到多株生防菌生防菌株对病原菌携带的Ti质粒类型具有选择性,如菌株K84只选择性地抑制含胭脂碱型Ti质粒的原生物Ⅰ型和Ⅱ型土壤杆菌[5],E26只对原生物Ⅲ型土壤杆菌引起的葡萄根癌病具有防治效果[6]等如何快速准确地鉴定出致病菌和致病菌的类型,对于种苗检疫、病害预测预报和制订防治对策都具有重要意义食用樱桃Cerasuspseudocerasus是山东泰安地区的主栽果树之一,近几年根癌病对其生长造成严重的影响,部分苗圃的发病率接近90%本研究旨在研究该地区樱桃根癌病病原细菌的分类地位,明确其生物分型,为生产上有针对性地防病治病提供理论依据1、材料与方法1.1主要培养基YMA培养基:K2HPO40.5g,CaCl20.2g,NaCl0.2g,MgSO4·7H2O0.2g,酵母浸粉1g,甘露醇10g,微量元素(1000×)2mL,蒸馏水定容至1000mL,pH7.2～7.4,琼脂15g,121℃灭菌20min后备用其中微量元素(1000×)的配方为:FeCl35g/L,MnCl20.1g/L,ZnCl20.5g/L。
1A培养基[7]:阿糖醇3.04g,NH4NO30.16g,KH2PO40.54g,K2HPO41.04g,MgSO4·7H2O0.25g,牛磺胆酸钠0.29g,0.1%结晶紫溶液2mL蒸馏水定容至1000mL,pH7.2～7.4,琼脂15g,121℃灭菌20min平板倾倒前每升加入2%放线菌酮10mL,1%Na2SeO3·5H2O10mL2E培养基[7]:赤藓糖醇3.05g,NH4NO30.16g,KH2PO40.54g,K2HPO41.04g,MgSO4·7H2O0.25g,牛磺胆酸钠0.29g,1%酵母提取物溶液1mL,0.1%孔雀绿溶液5mL蒸馏水定容至1000mL,pH7.2～7.4,琼脂15g,121℃灭菌20min平板倾倒前每升加入2%放线菌酮10mL,1%Na2SeO3·5H2O10mL1.2对照菌株A.tumefaciensK354,含质粒pTi58,为产胭脂碱和农杆菌素碱A的生物Ⅰ型致病性土壤杆菌;菌株A.rhizogenesK1026属非致病性土壤杆菌;以上菌株均由澳大利亚阿德莱德大学RyderMaarten教授提供1.3感病土壤及樱桃根癌组织取样地点取样地点位于山东泰安岱岳区夏张镇尹家庄村金旺大樱桃专业合作社的樱桃种植基地,土壤类型为棕壤,pH6.34,经检测土壤中总氮、磷、钾和有机质的含量分别为1.35、1.24、1.9g/kg和22.4g/kg。
试验地块有连续5年的中国樱桃育苗史,冠瘿病发病4年,部分地块发病严重取样时,小心完整地挖出感病植株根部,取部分根际土置于冰盒中然后清水清洗根部,用锋利的刀子取下瘤状组织,置于冰盒中带回实验室1.4根癌病原菌分离根部瘤状组织上病原菌分离采用常规分离法,选取根系上幼嫩瘤状组织用无菌水清洗干净,刮去表皮老化部分,切取10g瘤状组织,先用无菌水冲洗,放入0.52%的次氯酸钠溶液浸泡5min,然后浸入75%乙醇30s,再用无菌水冲洗3次将组织捣碎后加入90mL无菌水振荡,即为10-1浸提液,依次梯度稀释至10-6,每个稀释度取100μL分别涂布1A和2E培养基,设3个重复,放于26℃培养箱内培养2～4d,挑取不同形态菌株在YMA培养基上划线接种,直至纯化,保存根际土中病原菌的分离采取梯度稀释法,稀释至10-5后,分别涂布1A和2E培养基,26℃培养2～4d后,挑取不同形态菌株在YMA培养基上划线接种,直至纯化,保存1.5分离病原菌的鉴定1.5.1致病性鉴定采用胡萝卜切片法和番茄茎部针刺接种法[8]检测分离菌株的致病性供试胡萝卜根茎购买自菜市场,品种为‘春红二号’;供试番茄品种为‘佳粉15号’选择新鲜、无损伤的胡萝卜根茎,自来水清洗干净,用70%乙醇擦洗后火焰干燥,横切成5mm厚的圆片,用干净的手术刀片切除胡萝卜圆片外周部分,放在铺有水琼脂的培养皿内,靠近根端的一面朝上。
挑取在YMA培养基上生长24h的待测菌株,用无菌水制备成A600=0.3左右的菌悬液,各吸取30μL涂于胡萝卜圆片上每个菌株重复接种2～3个胡萝卜片,同时设无菌水对照,25℃培养2周左右观察结果取生长50d左右的健康番茄植株,每株番茄各取3个不同的枝条进行处理先用75%乙醇表面消毒,再用无菌注射针头轻刺并注射菌悬液10μL左右,以无菌水为阴性对照,2～3周后调查创伤处瘤状组织的产生情况1.5.2生理生化指标鉴定参照Schaad等[9]的方法检测待测菌株的3-酮基乳糖产生及对K2TeO3的耐受程度等1.5.2.13-酮基乳糖检测将分离纯化的病原菌接种至培养基上,置于26℃培养箱内培养至有明显菌落形成时,向平板上倒入Benedict试剂,室温放置30min以上,如果菌落四周出现黄色则为阳性,判断为原生物Ⅰ型培养基组分:乳糖10g,酵母膏1g,琼脂粉15g,蒸馏水1L,pH7.0～7.2Benedict试剂:CuSO4·H2O17.3g,Na2CO3100g,柠檬酸钠173g,蒸馏水1L1.5.2.2对K2TeO3的耐受程度[10]将分离纯化的病原菌接种至含不同浓度K2TeO3的YMA培养基中,26℃培养48h以上观察待测菌株对K2TeO3的耐受程度,一般原生物Ⅱ型的耐受程度高。
1.5.3致病菌的分子生物学鉴定挑取在YMA培养基上生长24h的待测菌株,接种至YM液体培养基中,26℃摇床培养36h(菌量约108cfu/mL),采用细菌DNA提取试剂盒(OmigaD3350),按照说明书的方法提取基因组DNA通过凝胶电泳检测DNA的质量并稀释至浓度为10～20ng/μL,分装并储存于-20℃用于进一步分析1.5.3.1致病菌的16SrDNA和recA基因的PCR扩增、测序选用16SrRNA细菌通用引物(27F,1492R)和recA基因的通用引物(F7386,F7387),序列分别为27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R:5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′和F7386:5′-AGCAAGGCACTGGAAGCGG-3′;F7387:5′-CCATACATGATGTCGAATTC-3′PCR反应程序为:94℃预变性5min;95℃变性lmin,55℃退火1min,72℃延伸1min30s,35个循环;72℃延伸10min反应完毕后0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,产物送往上海生工生物工程技术有限公司测序将序列提交至NCBI做BLAST分析,判断病原菌种类、属性及近缘的物种。
下载同源性高于98%的部分序列,使用MEGA5.1软件构建进化树,进化距离采用NJ邻位相连法,bootstrap设为1000构建进化树1.5.3.2病原菌的致病性相关基因检测根据土壤杆菌Ti质粒上与致病性相关基因的保守序列选取3对特异性引物,分别为T-DNA上异戊烯基转移酶基因ipt和tms2生长素基因,以及Ti质粒上VirD2保守序列,引物序列见表1以菌株K354为阳性对照菌株,无致病性的K1026为阴性对照菌株PCR反应程序:94℃预变性5min;95℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,30个循环;72℃延伸10minPCR反应结束后产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳以标准分子量作参照,在427、338bp和220bp处出现扩增条带者即相应基因为阳性,凝胶成像仪拍照记录结果表1致病性相关基因及引物序列1.5.3.3菌株Ti质粒的生物碱类型分子及化学鉴定Ti质粒的生物碱类型分别通过分子生物学和化学方法检测,其中分子生物学方法选取扩增Ti质粒上章鱼碱型和胭脂碱型土壤杆菌iaaH基因,胭脂碱合成酶基因nos和章鱼碱合成酶基因ocs,引物序列见表2PCR反应程序为:94℃预变性5min;95℃变性lmin,55～57℃退火1min,72℃延伸45s,30个循环;72℃延伸10min。
PCR反应结束后产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳以标准分子量作参照,在420、206bp和298bp处出现扩增条带的菌株即属相应的生物碱类型,凝胶成像仪拍照记录结果表2生物碱合成相关基因及引物序列化学方法鉴定致病菌生物碱类型采用高压纸电泳法[15],选择5株不同的致病菌接种胡萝卜切片,待长出瘤状组织后,小心切下称重,加入等重量体积的70%乙醇,充分研磨,14000r/min离心,取50μL上清液,以章鱼碱和胭脂碱标准品为对照进行高压纸电泳用Whatman3号滤纸搭桥,以5%乙酸作为电泳缓冲液,电压300V电泳结束后,用菲醌进行染色,在246nm波长的紫外灯下观察荧光斑点所在的位置2、结果与分析2.1樱桃根癌病病原菌分离以阿糖醇和赤藓糖醇为碳源,分别制备选择性培养基1A和2E,相同土壤和瘤状组织样品经不同培养基培养,发现在2E培养基上菌落为乳白色,在1A培养基生长出的菌落呈砖红色(图1),且2E培养基上长出的菌落数比1A培养基上多在两种培养基上长出的大多数菌落呈圆形突起,边缘齐整,与土壤杆菌群落形态相似但也有个别菌落形态上存在差异,剔除差异大的单菌落后,检测的3块不同樱桃根部瘤状组织2E上长出的菌落数平均为2.75×108cfu/g,1A上为3.77×107cfu/g;感病土样在2E培养基上的菌落数为3.1×105cfu/g,1A培养基上几乎没有菌落生长。
Brisbane等[7]研究了原生物Ⅰ型土壤杆菌只能利用阿糖醇作为碳源,在1A培养基上生长的为砖红色菌落,原生物Ⅱ型土壤杆菌只能利用赤藓糖醇作为碳源,在2E培养基上生长为乳白色菌落初步说明从泰安樱桃根癌组织和感病土样中分离的菌株以原生物Ⅱ型为主图1樱桃瘤状组织中分离的待测菌株在2E和1A培养基上的菌落形态2.2分离菌株的致病性检测从2E培养基上纯化出30株菌株,1A上纯化出10株菌株,分别接种胡萝卜切片和番茄枝条验证其致瘤活性结果显示:1A上分离的10株菌株只有2株具有致瘤活性,接种2周后可使胡萝卜次生木质部周围产生乳黄色的瘤状组织,也可使番茄茎部接种部位产生瘤状突起(图2);从2E培养基上分离的30株菌,除C11-34外,其他29株均具有致瘤活性2.3致病菌的生理生化检测任意选取12株病原菌(2E分离的10株,1A分离的2株),以有致病活性的K354为原生物Ⅰ型。