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1、注射用益气复脉(冻干)体外抗氧化活性测定方法氧自由基是引发心血管疾病的关键因素之一，有效的抗氧化治疗对防治心血管疾病具有广泛的应用前景。注射用益气复脉（冻干）（YQFM）由红参、麦冬和五味子3味主药组成，具有益气复脉、养阴生津功效，临床上用于治疗冠心病劳累型心绞痛及慢性心功能不全等心血管疾病8,9。本研究通过对一定浓度的YQFM溶液与等体积的DPPH溶液混合均匀并放置一定时间后，测定其吸光度（A）值相对于DPPH控制液（由DPPH溶液与等体积溶剂混合）的变化情况（DPPH自由基清除情况），计算YQFM对DPPH自由基的半抑制浓度（IC50），进而评价其体外抗氧化活性，以期为YQFM在该类疾病的
2、防治提供科学依据。1、材料1.1主要仪器BioTekEpoch全波长酶标仪（数字本草中药检测有限公司，资产编号TJ-01-902，波长范围200999nm);DR5000型紫外可见分光光度计（HACH公司）；电子分析天平（美国MettlerToledo公司，型号：XS105、ME104/02）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号KQ3200E）；超纯水仪（Millipore公司，型号Milli-QAdvantageA10);Researchplus手动移液器（艾本德（上海）国际贸易有限公司，规格0.0200.100mL、0.1001.000mL、0.55mL和110mL等）；96孔微孔
3、板（Corning公司，型号3599，批号04310015）；容量瓶（德国BLAUBRAND);Vortex-Genie2漩涡混合器（美国ScientificIndustries公司，型号Vortex-Genie2）。1.2试剂、试药和耗材AscrobicAcid（抗坏血酸Vc)(Sigma公司，批号LRAA8956);2,2-二苯基-1-(2,4,6-三硝基苯基）肼基（DPPH)(Sigma公司，批号STBG8547）；无水乙醇（天津市康科德科技有限公司，批号190116);YQFM（天津天士力之骄药业有限公司，规格：每瓶装0.65g，共计30批）；YQFM随行对照（天津天士力之骄药业有限公
4、司，为多批次YQFM混合样品）；甘露醇（北京凤礼精求商贸有限责任公司，批号F838B）；葡甲胺（西安力邦制药有限公司，批号151203B）；注射用麦冬提取物（天津天士力之骄药业有限公司，批号20181001）；注射用红参提取物（天津天士力之骄药业有限公司，批号20181109）；注射用五味子提取物（天津天士力之骄药业有限公司，批号20181201）。2、方法2.1溶剂的选择一般选择甲醇或乙醇作为DPPH的溶剂，综合考虑YQFM处方组成（注射液麦冬提取物、注射液红参提取物、注射用五味子提取物、甘露醇和葡甲胺）和制备工艺、甲醇的毒性和设备检测原理，选择以无水乙醇作为其稀释溶剂。2.2检测波长的确定
5、精密称取DPPH适量，加无水乙醇制成质量浓度为0.056mg/mL的溶液，混合均匀。精密吸取上述溶液和无水乙醇各0.200mL，加入96微孔板的底部，利用酶标仪在190900nm波长范围内对其进行扫描：0.056mg/mL的DPPH溶液在230、325、517nm处有较强吸收；而无水乙醇溶剂在230nm处有强吸收，在325nm附近有较强，而517nm处吸收与空白96微孔板接近；因此本研究选择517nm作为考察波长。2.3不同空白吸收考察分别精密吸取3种空白溶液（超纯水、无水乙醇和无水乙醇和超纯水等体积混合溶液）各0.200mL，加入96孔微孔板中，测定3种溶剂和与空微孔在517nm处A值分别为
6、0.088、0.082、0.085和0.085,3种溶剂的A值接近，且与空微孔的A值接近。结果提示，3种空白溶剂对517nm处吸收干扰相对较小，采用3种溶剂对样品进行处理对试验结果影响可忽略。2.4专属性考察（干扰试验）依据YQFM处方配比，分别称取甘露醇、葡甲胺、注射用麦冬提取物、注射用红参提取物、注射用五味子提取物和YQFM适量，分别加超纯水适量分别配制成质量浓度为2.5088、0.0806、1.4867、0.3270、0.1446和20.8mg/mL的溶液，分别精密吸取上述6种溶液，在190700nm波长范围内进行扫描。上述6种溶液在490590nm处均无吸收峰；在517nm处的A值（依
7、次为：0.085、0.083、0.086、0.083、0.082和0.087）与96孔微孔板的空微孔A值接近，因此可认为过量的辅料、提取物和YQFM对A值的影响可忽略。结果见图1。2.5反应平衡时间的确定不同抗氧化剂与DPPH自由基的反应动力学不同，反应达到平衡所需的时间也有所不同。因此有必要考察YQFM与其反应平衡时间，分别于535min进行考察。精密称取DPPH适量，加无水乙醇配制成质量浓度为0.1329mg/mL的DPPH溶液；精密称取YQFM适量，加超纯水配制成质量浓度为10.25mg/mL的YQFM溶液。分别精密吸取：（1)DPPH溶液和YQFM溶液各0.100mL，混合均匀作为样品
8、溶液；（2)DPPH溶液和无水乙醇各0.100mL，混合均匀，作为控制溶液；（3）以超纯水0.500mL和无水乙醇0.500mL的混合溶液作为空白溶液，室温下分别按照表1中时间测定其517nm处A值。由表1数据可知：样品溶液在035min内A值比较稳定，可认为其在5min已达反应平衡；综合考虑样品处理时间，后续试验反应时间建议在2535min的时间范围内。图1YQFM及其各组分UV-VIS扫描图2.6DPPH线性考察精密称取DPPH适量，加适量无水乙醇制成DPPH储备溶液，分别吸取储备溶液适量，配制成9个质量浓度（0.0797、0.0709、0.0620、0.0532、0.0443、0.035
9、4、0.0177、0.0089、0.0035mg/mL）的溶液。精密吸取9个DPPH溶液各0.200mL，加入至96孔微孔板中，以无水乙醇作为空白溶液，测定其517nm处的A值。DPPH溶液浓度在0.00350.0797mg/mL范围内线性良好，其线性方程为y=-9.92003x2+13.19106x-0.01295,R=0.99802。2.7YQFM线性考察精密称取YQFM适量，加超纯水配制成12.5188、11.0460、9.5732、7.3640、5.5230、3.6820、1.4728mg/mL8个质量浓度的溶液，精密吸取8个溶液各0.500mL，分别加入质量浓度0.1418mg/mL
10、的DPPH溶液0.500mL，混合均匀，室温下反应2535min，作为样品溶液。以DPPH溶液0.500mL和无水乙醇0.500mL的混合溶液作为控制溶液，以超纯水0.500mL和无水乙醇0.500mL的混合溶液作为空白溶液。精密吸取上述各溶液0.200mL，加入至96孔微孔板中，分别测定其517nm处的A值。YQFM反应溶液质量浓度在1.472812.5188mg/mL线性良好，其线性方程为y=-0.00294x2+0.11128x-0.10774,R=0.99102。表1反应平衡时间检测结果A=A控制-A样品2.8精密度试验精密称取YQFM适量，加超纯水适量配成6个质量浓度（1.7658、
11、3.5316、5.2974、7.0632、8.8290、10.5948mg/mL）的溶液。精密吸取6个浓度的溶液各0.500mL，分别加入质量浓度为0.1418mg/mL的DPPH溶液0.500mL，混合均匀，室温下放置2535min，作为样品溶液。精密吸取6个样品溶液各0.200mL，加入至96孔微孔板中，测定其517nm处A值（重复测定6次）。YQFM6个浓度溶液精密度试验结果均符合规定，RSD分别为1.5%、1.8%、1.7%、1.1%、0.7%、0.5%(RSD2%）。2.9重复性试验精密称取YQFM适量，加超纯水适量配成6个质量浓度（10.5960、8.8300、7.0640、5.2
12、980、3.5320、1.7660mg/mL)YQFM溶液各6份。分别精密吸取上述浓度的YQFM溶液各0.500mL，分别加入质量浓度为0.1418mg/mL的DPPH溶液0.500mL，混合均匀，室温下放置2535min，作为样品溶液。以质量浓度为0.1418mg/mL的DPPH溶液0.500mL和无水乙醇0.500mL的混合溶液作为控制溶液，以超纯水0.500mL和无水乙醇0.500mL的混合溶液作为空白溶液。精密吸取上述样品溶液各0.200mL，加入至96孔微孔板中，测定其517nm处A值。分别计算各浓度样品的A值变化量，以每组样品的浓度-A值变化量进行趋势拟合，分别计算其IC50，并对
13、其进行对比分析。由表2数据可知，6组样品的IC50均值为7.47mg/mL,RSD为0.6%，重复性符合规定（RSD2%）。2.10耐用性试验精密称取YQFM适量，加超纯水适量，配制成表3中所列质量浓度的溶液。精密吸取15个质量浓度的YQFM溶液各0.500mL，分别加入质量浓度为0.1418mg/mL的DPPH溶液各0.500mL，混合均匀，室温下反应2535min，作为样品溶液。以超纯水0.500mL和0.500mL的无水乙醇混合溶液作为空白溶液，以质量浓度为0.1418mg/mL的DPPH溶液0.500mL和0.500mL的无水乙醇混合溶液作为控制溶液。精密吸取上述样品溶液、空白溶液和控
14、制溶液各0.200mL，加入至96孔微孔板中，室温下放置2535min，分别测定其517nm处的A值。由表3中数据可知：高质量浓度下得到的IC50比中、低质量浓度下的IC50浓度高，其可能与高质量浓度下YQFM溶液与DPPH溶液反应完全程度不如中、低质量浓度有关；当以15个质量浓度数据进行拟合后得到的IC50为6.21mg/mL，与中、低质量浓度得到的IC50结果较为接近，因此建议采用较为宽的浓度范围对样品进行测定，以更加准确的反应其对DPPH自由基的清除。2.11关于趋势线拟合通过对不同质量浓度的DPPH溶液的浓度-A值、不同质量浓度的YQFM随行对照溶液浓度与其和DPPH溶液反应后A值变化
15、量进行5种趋势拟合结果见表4。一次函数（线性）拟合、二次函数（多项式）拟合结果优于其他3种拟合方式。通过对多批次样品的测定数据拟合后发现，二次函数（多项式）拟合结果优于一次函数（线性）的拟合结果，因此后续样品测定数据采用二次函数（多项式）趋势拟合。2.12样品检测选取20162019年30批的YQFM，分别测定了其IC50并与随行对照的IC50进行比较，相关结果见表5和图2。YQFM的IC50均值为4.07mg/mL(3.345.20mg/mL），其相对抗氧化强度为113%(87%135%）。表2趋势拟合和IC50计算结果表3耐用性试验结果A=A控制-A样品3、讨论YQFM由红参、麦冬和五味子
16、3味主药组成，据张馨妍等10,11,12,13,14,15,16,17,18报道，红参中的主要成分皂苷类和多糖类具有一定的抗氧化性；据赵荣华等19,20,21,22,23,24,25,26报道，麦冬中的主要成分多糖类和皂苷类具有一定的抗氧化性；据邱明阳等27,28,29,30,31,32,33,34,35报道，五味子中的主要成分木脂素类和酚酸类物质具有一定的抗氧化性。通过对20162018年55批YQFM的进行检测分析：其所测成分中总糖、总酸、总皂苷、总无机物含量分别为80.81%、4.13%、2.39%和2.73%，所测成分占总固体量的90.07%；已结构明确的4种糖、5种有机酸、5种皂苷、五味子醇甲、钠元素、5-羟甲基糠醛和水分的含量分别为66.22%、1.84%、0.79%、0.04%、1.12%、0.03%和0
