基于网络药理学研究方法探讨二陈汤治疗慢性阻塞性肺病的作用机制慢性阻塞性肺疾病是以进行性发展的不完全可逆的气流受限为特点的常见慢性呼吸道疾病,据报道,全球40岁以上成年人的慢阻肺患病率在5%～19%[1]预计到2030年,慢阻肺将上升到全球第3位死亡原因[2]随着空气污染、香烟烟雾和生物燃料等有害气体的排放,COPD在我国也成为了位列第3位的疾病负担和死因[3]目前COPD的发病机制尚不明确,相关研究显示,COPD的发病机制多与气道炎症、氧化应激、线粒体功能障碍、上皮-间充质转化、衰老、铁离子代谢和基因多态性等有关[4]本病的病程长,反复发作,严重影响患者的生活质量,诸如肺心病、肺动脉高压等并发症还时刻威胁着患者的生命目前西医治疗多采用糖皮质激素及支气管扩张剂等药物,虽然可以暂时缓解患者症状,但副作用较多,远期效果不理想因此,进一步挖掘COPD发生的病理机制,对于寻找多靶点、高效、副作用低的治疗COPD的药物具有重要意义二陈汤出自于北宋的《太平惠民和剂局方》,是历代公认的祛痰剂祖方[5]由陈皮、半夏、茯苓、甘草组成,有燥湿化痰,理气和中之效现有研究表明,二陈汤加味方能有效改善COPD大鼠气流受限和肺功能[6],并可能通过促进IL-4的合成与分泌,降低COPD大鼠IL-1β的含量,降低大鼠肺组织中的VEGF,VEGFR2蛋白表达,从而减轻COPD大鼠的肺组织炎症,以此达到抑制大鼠肺内组织重构[7]。
但现有的研究多采用实验动物或者细胞实验对某一机制进行探索研究,获得信息较为局限,不能较准确涵盖真实的作用机制[8],二陈汤对COPD的作用机制尚未能明确阐明,对二陈汤的有效应用带来了局限为了进一步探寻二陈汤对COPD的作用机制,提升和精准二陈汤的开发和临床用药,为基础研究和临床用药提供研究基础,本研究运用网络药理学相关数据库,对疾病、药物信息进行收集和分析,以期进一步为二陈汤治疗COPD提供新的思路1、资料与方法1.1二陈汤化学成分筛选1.2二陈汤活性成分潜在靶点预测1.3COPD相关靶点预测1.4二陈汤治疗COPD靶点预测将上述二陈汤的预测靶点与COPD的预测靶点取交集,得到二陈汤与COPD的共同作用靶点,即为二陈汤治疗COPD的潜在靶点1.5成分网络图构建将二陈汤药物组成、活性成分以及共同作用靶点导入Cytoscape3.7.2软件中,构建成分-靶点-疾病网络图1.6蛋白质-蛋白质相互关系网络构建机体的内在调控往往是复杂的调控网络,而蛋白质-蛋白质相互作用关系(protein-proteininteraction,PPI)数据的挖掘为寻找靶点相互作用关系提供了可能[13]将二陈汤和疾病的共同作用靶点导入STRING数据库(https://string-db.org/)构建PPI网络,将物种设置为“Homosapiens”,并将数据导入Cytoscape3.7.2实现可视化。
1.7GO功能富集分析与KEGG分析将二陈汤活性成分靶点与COPD共同靶点导入DAVID6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行基因本体论(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析选择物种为人(homosapiens)筛选条件设置为:Count≥4,P≤0.01,FDR(FalseDiscoveryRate)≤0.01,得到的生物过程富集和通路富集2、结果2.1二陈汤活性化学成分筛选收集在TCMSP数据库中搜索二陈汤得到药物的活性成分共493个,其中半夏116个,陈皮63个,茯苓34个,甘草280个基于ADME参数OB≥30%,DL≥0.18的条件初步筛选出112个有效成分,其中半夏13个,陈皮5个,茯苓15个,甘草79个2.2二陈汤活性成分靶点预测利用TCMSP数据库进行活性成分的靶点预测,并将所获得的预测靶点导入Uniprot数据库进行基因标准化,删除重复值后共得到作用靶点142个将上述药物、成分及靶点导入Cytoscape软件进行网络可视化图中蓝色六边形代表药物二陈汤,橙色菱形代表二陈汤成分节点,绿色倒三角形代表成分预测靶点,节点之间的边表示成分与靶点之间的相互作用关系。
其中预测靶点按degree值进行分析,Degree值越大,表示与其他的靶点联系越密切结果见图1图1二陈汤—成分—靶点网络图2.3COPD靶点预测在DisGeNET数据库找到148个预测靶点,CTD数据库找到70个预测靶点;GeneCards数据库找到263个预测靶点;OMIM数据库找到199个预测靶点;PharmaGKB数据库找到7个预测靶点,GAD数据库找到72个预测靶点;KEGG数据库找到3个预测靶点去除重复值后共得到靶点509个2.4二陈汤治疗COPD靶点网络构建将二陈汤的预测靶点与COPD的预测靶点共同导入EXCEL表格查找重复值并取交集,共得到45个共同作用靶点将此45个共同预测靶点导入STRING数据库,构建蛋白质—蛋白质相互作用关系(Protein-ProteinInteraction,PPI)网络图,以此来寻找靶点和靶点间直接及间接作用关系用圆圈的大小表示自由度(degree值)的大小,圆圈越大,degree值越大,参与的生物功能越多如图2所示,图中包含45个节点,448条边,其中最小自由度2,最大自由度36,平均自由度20关键靶点为:IL6,TP53,VEGFA,ILB1,MAPK1,PTGS2,TNF,CCL2,EGFR,EGF等。
图2二陈汤治疗COPD的PPI网络图2.5GO功能富集分析与KEGG分析图3二陈汤治疗COPD的生物学进程分析图4二陈汤治疗COPD的KEGG通路分析3、讨论本研究通过多个数据库收集得到COPD的509个靶点,提示COPD的发生可能由多个靶点共同导致的二陈汤与COPD的共同预测靶点为45个,通过GO分析,结果显示二陈汤作用于COPD的机制中,主要涉及了氧化应激、脂多糖介导的信号通路、一氧化氮合成、血管生成、趋化因子生成、细胞凋亡、细胞增殖、RNA转录等多个生物学进程,多个生物学进程涉及了IL6、TNF、EGFR、IL1B、MAPK14、NOS3、VEGFA、TP53、IL2等靶点相关研究证实无论是COPD患者还是COPD动物模型,其肺组织中均存在内皮细胞凋亡的增加[14,15]TargowskiT等[16]研究发现,较健康人相比,COPD患者血清中p53蛋白表达明显升高,这提示了P53基因参与了COPD肺组织细胞调亡的进程COPD的主要病理机制之一是炎症反应,而IL家族是COPD重要的炎症因子,可参与COPD发病的多个过程IL-6在COPD患者中的表达明显升高,并且能够刺激B淋巴细胞分化及T淋巴细胞增殖,诱导二者释放多种炎性介质加重肺部炎症反应[17],同时IL-6与COPD患者肺动脉高压、肺功能、血管炎等相关[18]。
血管内皮生长因子,是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子,可在体内诱导血管新生有研究指出,VEGF能够促进内皮细胞增生、纤维化,促使单核细胞趋化积聚引发炎症反应[19],从而加重COPD的病情,提示了VEGF是COPD患者肺组织血管发生病变的关键因素之一富集分析共得到7条通路,其中HIF-1信号通路和TNF信号通路在COPD的发病中最为重要,此外还与许多癌症相关通路、类风湿关节炎的发病有关联COPD患者普遍存在缺氧的病理表现,为了应对缺氧胁迫,缺氧诱导因子-1(Hypoxiainduciblefactor-1,HIF-1)在此过程发挥了重要作用,HIF-1由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成[20]在低氧环境中,HIF-1α在细胞内积聚并与HIF-1β结合形成HIF-1,HIF-1与HRE结合并参与多条信号转导通路,引起细胞对缺氧的反应[21]现有研究表明COPD患者肺小动脉HIF-1αmRNA及蛋白表达均明显增强,与管壁厚度和管壁面积呈正相关,提示HIF-1α可能参与了COPD气道重塑和肺动脉高压形成的发病过程[22]拮抗HIF-1α、VEGF的表达,可以减轻COPD的肺血管重构,减缓其到肺动脉高压的进展[23]。
肺胀的记载最早见于《黄帝内经》,其中《灵枢·经脉》曰:“肺手太阴之脉,……是动则病肺胀满膨膨而喘咳《灵枢·胀论》:“肺胀者,虚满而喘咳”均有论述[24],中医学虽然没有“慢性阻塞性肺疾病”的病名,但结合其临床表现,一般认为隶属于中医的“喘证”“肺胀”等范畴病机是由多种慢性肺系疾患反复发作,迁延不愈,肺脾肾三脏虚损,从而导致肺气胀满,不能敛降的一类病证,久病肺虚,肺病及脾,湿阻不化,聚湿成痰,痰浊、水饮停留,病久成瘀,三者常常互为影响并且相互转化痰饮的产生,初由肺气郁滞,脾失健运,津液不归正化而成,渐因肺虚不能布津,脾虚不能转输,肾虚不能蒸化,痰浊潴留益甚在此过程中痰饮的作用尤为重要,痰瘀阻结于气道,导致肺体胀满,表现为痰热证痰热内扰,蒙蔽心窍,心神失主,则表现为意识朦胧、嗜睡甚至昏迷,痰热内闭,热邪耗灼营阴,肝肾失养,阴虚火旺,肝火挟痰上扰,肝风内动则发生肢颤、抽搐;痰热迫血妄行,则动血而致出血而二陈汤长于燥湿化痰,理气和中方中半夏、陈皮相辅相成,增强燥湿化痰之力,体现治痰先理气,气顺则痰消之意,佐以茯苓健脾渗湿,渗湿以助化痰之力,健脾以杜生痰之源,甘草为佐使,健脾和中,调和诸药,正切合病机。
本研究从网络药理学的角度系统的预测了二陈汤治疗COPD的潜在分子机制,二陈汤作用于COPD的靶点通路之间存在多种多样的相互作用关系,其作用机制涉及多通路、多靶点,因此在治疗COPD之时,不仅要针对局部关键通路,还应针对疾病病因、所处机体环境的差异进行多靶点、多系统干预,例如寻找核心靶点,或是其信号通路的上游或下游分子这也恰恰也印证了中医多靶点、多方面进行综合干预的可行性和优势,为后续机制的进一步探讨和实验设计的优化及临床应用等提供了重要的理论依据参考文献：[4]李锋,周新.慢性阻塞性肺疾病的发病机制研究进展[J].中国呼吸与危重监护杂志,2019,18(1):88.[5]包永生,谢文英,王俊月.二陈汤研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2019,25(23):9.[6]谢文英,王俊月,包永生,等.二陈汤加味对慢性阻塞性肺疾病大鼠β2AR/β-arrestin2信号通路的影响[J].中国实验方剂学杂志,2019,25(23):34.[7]谢文英,王俊月,包永生,等.二陈汤加味对慢性阻塞性肺疾病大鼠VEGF,VEGFR2,IL-4,ET-1的影响[J].中国实验方剂学杂志,2019,25(23):48.[8]咸哲民,王重阳,朴玉华,等.欧前胡素通过TGF-β1/Smad3和PI3K/Akt信号通路对哮喘小鼠气道重塑模型的影响[J].中国药理学通报,2018,34(12):1719.[20]高秀芳,施海明,山缨,等.红景天对低氧条件下内皮细胞HIF-1α､HIF-1β和VEGF表达的影响[J].中华中医药杂志,2010,25(4):582.[21]魏文婷,李冰,贾晔然,等.慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中缺氧诱导因子1α的表达变化[J].中国病理生理杂志,2013,29(9):1700.[22]李启芳,戴爱国,徐平.慢性阻塞性肺疾病患者肺小血管低氧诱导因子-α的表达[J].中华内科杂志,2006,45(2):136.[23]凌书策.芪蛭益肺颗粒治疗慢性阻塞性肺疾病的机制研究[D].北京中医药大学硕士学位论文,2019.刘施吟,赵冰清,陈宪海.基于网络药理学的二陈汤治疗慢性阻塞性肺病的分子机制研究[J].时珍国医国药,2020,31(03):761-764.。