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1、免疫学实验技术伍志强解放军总医院生命科学院基础医学所基础医学免疫学实验技术1免疫学实验技术抗体l定义：指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。医学应用：科研应用：免疫共沉淀、免疫印迹、染色质免疫共沉淀、免疫荧光技术、ELISA等1.诊断：各类血清学检测，抗人球蛋白测试，早孕检测 等2.治疗：单克隆抗体疗法（类风湿性关节炎多发性硬化症等），肿瘤治疗。基础医学免疫学实验技术多抗来源l动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不
2、同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中，即为多克隆抗体。 基础医学免疫学实验技术多克隆抗体制备动物选择：兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多。（新西兰,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品）。马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。豚鼠（guinea pig）：国外实验室常用。基础医学免疫学实验技术
3、基本步骤延长抗原的作用时间增强吞噬作用刺激抗原提呈促进细胞因子分泌诱导淋巴细胞分裂、增殖影响T细胞“极化”佐剂的作用机理：抗原制备：商品化或自行表达基础免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全佐剂（Complate Freund adjuvand ,含矿物油,卡介苗等)。加强免疫：第2次以后，抗原量减半，多次，间隔2-4周，用佛式不完全佐剂(Incomplate Freund adjuvand ,不含卡介苗).取血测效价： 加强免疫两次或三次以后的第7天取血。放血制备血清：可一次放血(颈动脉)也可多次取血(耳静脉)基础医学免疫学实验技术实验方法l新西兰大耳白，2000g(雌雄均可),健康,无病原l基
4、础免疫0.5ml抗原(含0.250.5mg蛋白或108颗粒抗原)0.5ml佛式完全佐剂(CFA)制备抗原-佐剂乳化液背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射l加强免疫间隔2-4周,可进行多次0.5ml抗原(蛋白量减半)0.5ml佛式不完全佐剂(IFA)制备抗原-佐剂乳化液背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射基础医学免疫学实验技术实验方法l免疫34次以后从耳静脉取血检测效价酶联法：1:104以上，能达到1:106。免疫双扩散： 1:16以上，能达到1:64l效价达到要求的可放血制备血清可一次放血(颈动脉)也可多次取血(耳静脉)基础医学免疫学实验技术多抗的特点l多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质是一个
5、群体综合的性质。l比单抗更容易捕捉抗原。因为含有抗不同表位的抗体，多种抗体都可与抗原结合。l特异性相对较差：因为由不同性质的抗体组成，只要其中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉反应，所以多抗更容易有交叉反应。l 抗体的纯化、标记比单抗难：因为含有各种不同类型、亚类的抗体，提纯、标记的方法有所差别。同时,血清中含有的杂蛋白比较多。基础医学免疫学实验技术什么情况下需要制备单克隆抗体l目的蛋白有结构类似物l抗原不纯，无法分开l多抗效果不好（已排除非特异性反应）l希望将抗体用于治疗，研制成药品l希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂基础医学免疫学实验技术单抗制备原理l如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行
6、培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。l1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。l利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间
7、所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。 基础医学免疫学实验技术单抗制备原理HGRPT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 TK：胸腺嘧啶核苷激酶HAT：次黄嘌呤（H)、胸腺嘧啶核苷（T)、氨基蝶呤（A)基础医学免疫学实验技术基本步骤基础医学免疫学实验技术实验方法l免疫小鼠l选择体重1820g BALB/C 雌性小鼠，用制备抗原免疫。50100ug抗原/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.5ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次皮下多点注射0.5ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。l细胞融合l取上
8、述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50% PEG（Sigma）作为融合剂，在37下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37，5%CO2的细胞培养器皿中培养。基础医学免疫学实验技术阳性细胞筛选l细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔
9、。l阳性孔的特异性鉴定采用间接ELISA方法，用包被液稀释成110ug/mL的抗原100ul/孔包被ELISA板，4过夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用110的脱脂奶粉或13 BSA或36牛血清封闭30-60min;加入阳性孔培养上清100ul/孔，37 12 小时；PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37 12小时，PBST洗涤四次后，用OPD-H2O2底物显色，2mol/L H2SO4终止反应后，用酶标仪读取OD492的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。获分别对上述抗原有特异性反应的阳性孔。
10、l筛选出的特异性阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获对上述抗原有特异性反应的杂交瘤细胞株。细胞株进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存。基础医学免疫学实验技术杂交瘤细胞的冻存l杂交瘤细胞通常用含有8-10%的二甲亚砜和20小牛血清的培养基冻存于液氮中，在液氮中细胞可以保存多年，在-80中可以作3-6个月短期保存。冻存细胞需要缓慢降温，复苏细胞时需快速升温，这样可以确保细胞有较高的存活率。基础医学免疫学实验技术单克隆抗体腹水制备及纯化l取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大
11、，采取腹水，2000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。l辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体：取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70保存。基础医学免疫学实验技术其他抗体纯化方法q盐析法（硫酸铵沉淀)q离子交换法q亲和层析法q凝胶过滤法基础医学免疫学实验技术盐析法（硫酸铵沉淀)l原理在高浓度中性盐存在下,
12、蛋白质在水中的溶解度降低而产生沉淀硫酸铵是最常用的中性盐不同蛋白质的盐析常数不同硫酸铵的加入量通常以饱和度表示 (100%饱和度:767g/L)特点成本低，步骤简单。抗体的回收率比较高。抗体纯度比较低，电泳后可见到明显的杂带,不适合于做各种标记。需要高速离心机。基础医学免疫学实验技术正辛酸-硫酸铵沉淀法l原理两步沉淀：先加正辛酸去杂蛋白. 正辛酸是一种有机酸,在酸性条件下(pH4.5)可使大分子的杂蛋白沉淀.后加硫酸铵使抗体沉淀.n特点成本较低，步骤较复杂。抗体回收率很低。抗体纯度高，电泳后杂带很少，适合于各种标记。需要高速离心机，耐高速离心的玻璃离心管。基础医学免疫学实验技术离子交换法l原理
13、利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离.DEAE是一种阴离子交换剂，自身带正电荷 (Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基)将样品的pH值调至等电点以上,使样品带负电荷.采用盐溶液洗脱,通过高浓度的带同种电荷的离子(Cl-)置换被分离的组分.特点成本较低，步骤较简单。抗体回收率较高。抗体纯度较高，电泳后可见少量杂带，适合于各种标记。纯化后抗体体积大，需要浓缩。需要冷柜，自动收集器。基础医学免疫学实验技术亲和层析法l原理利用蛋白质之间的特异性结合 （抗体-抗原，受体-配体）将一种配基与凝胶颗粒结合,捕捉与它相配的物质。洗脱一般采用改变pH值的方法特点成本较低，步
14、骤较简单。抗体回收率较高。抗体纯度较高，电泳后可见少量杂带，适合于各种标记。纯化后抗体体积大，需要浓缩。需要冷柜，自动收集器。基础医学免疫学实验技术凝胶过滤法(分子筛)l原理将样品混合物通过一定孔径的凝胶介质,由于流经路径的差异,使不同分子质量的组分分离.大分子物质直接从凝胶颗粒外通过，走得快；小 分子物质进入凝胶颗粒的内部再出来，走得慢。适合于IgM类抗体的纯化 (五聚体,分子量约800KD)n特点成本高，步骤较简单。抗体回收率较高，分离条件缓和，抗体活性不受影响。抗体纯度较高。需要自动收集器。基础医学免疫学实验技术纯化方法选择原则l不需要纯化则不纯化；（具体应用）l依据后续实验需求及实验室
15、条件。基础医学免疫学实验技术腹水效价测定l用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，腹水效价在10-5-10-7之间的可用于实际应用。基础医学免疫学实验技术单抗与多抗比较 单抗 多抗抗体组成 单一 复杂 抗体性质 个体的属性 群体综合的性质纯化标记 容易，效果好 难度高一些 种属来源 绝大多数是小鼠 兔、羊、豚鼠等制备周期 长 (最短4个月） 短（2个月）制备技术 复杂 简单经费 多 少 基础医学免疫学实验技术l酶联免疫吸附试验（ELISA）l蛋白免疫印迹（Western blot）l免疫荧光技术（IF）l免疫共沉淀（Co-IP)l染色质免疫共沉淀（Ch-IP)基础医学免疫学实验技术ELISA
16、基本原理l酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。l在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 基础医学免疫学实验技术lELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）；（3）酶反应的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。基础医学免疫学实验技术常用ELISA方法l1）直接ELISA：待测抗原直
