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1、SFRP基因甲基化与临床病理特征及HPV感染的关系子宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，原位癌高发年龄为3035岁，浸润癌高发年龄为4555岁，其病理类型主要分为鳞状细胞癌、腺癌及腺鳞癌，其中以鳞状细胞癌为最常见1。有研究显示，子宫颈癌发病率和病死率位居我国女性恶性肿瘤第2位，仅次于乳腺癌，发病率和病死率逐年上升并呈年轻化趋势1,2。子宫颈癌发生及发展是一个涉及多因素、多基因及多阶段的复杂过程，人乳头瘤病毒感染已被证实是子宫颈癌发生及发展的主要因素，子宫颈癌患者HPV感染率可高达90%2。除此之外，表观遗传学改变在子宫颈癌发病过程中也具有重要作用3。DNA甲基化是表观遗传学的重要分支，能够引起染色质
2、结构改变、DNA构象及稳定性改变，在基因表达调控、基因组印迹及发育调节等方面起到重要作用4。分泌型卷曲相关蛋白是细胞外因子信号通路的拮抗因子，可通过半胱氨酸富集区域与Wnt配体结合而阻断Wnt信号转导，抑制肿瘤增殖5。有研究显示SFRP基因甲基化与乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤相关6，但其与子宫颈鳞状细胞癌相关性尚不清楚。因此本研究就子宫颈鳞状细胞癌患者SFRP基因甲基化与其临床病理特征及HPV感染的关系进行探讨，报告如下。1、资料与方法1.1一般资料经医院伦理会审查批准，选择2018年8月2019年8月收治的87例子宫颈鳞状细胞癌患者，收集其术中切除的癌组织及配对癌旁正常组织。患者年龄2570岁、
3、中位年龄50岁，50岁59例、50岁28例，肿瘤直径4cm58例、4cm29例;FIGO分期期73例、期14例，WHO病理分级G1级37例、G2级29例、G3级21例。纳入标准:(1)子宫颈鳞状细胞癌经病理学检查确诊1;(2)未合并其他恶性肿瘤;(3)入院资料详细;(4)入院前未接受任何抗癌治疗;(5)所有研究对象及其家属同意入组该实验，并获得书面知情同意书。排除标准:(1)合并凝血系统疾病、自身免疫性疾病、传染性疾病、精神系统疾病、感染性疾病;(2)合并心、肝、脾、肺、肾、脑等重要脏器功能障碍;(3)妊娠或哺乳期女性;(4)依从性差;(5)合并转移性肿瘤。1.2方法1.2.1SFRP基因甲基
4、化检测采用甲基化特异性聚合酶链式反法，收集子宫颈鳞状细胞癌患者术中切除的癌组织及配对癌旁正常组织，采用组织基因组DNA提取试剂盒(杭州博日科技有限公司)提取DNA，采用DNA甲基化试剂盒(上海信裕生物科技有限公司)进行DNA变性及亚硫酸氢盐转化。以转化后的DNA为模板，进行PCR扩增。设计SFRP基因甲基化特异引物和非甲基化特异引物，甲基化特异引物上游为5-GGTATATTTTCGAGGGGTACG-3，下游为5-TTCCCGACCCGCACTCCGC-3;SFRP基因非甲基化特异引物上游为5-TGTGAGGGTATATTTTTGAGGGGTAT-3，下游为5-CTTCTCTCTCCACTTC
5、CCAACCCA-3。PCR反应体系:DNA模板1L,5PCR缓冲液10L，上下游引物各0.5L，加无核酶水补充至20L。PCR反应条件:95预变性120s,95变性60s、55退火60s、72延伸60s,40次循环。PCR产物经凝胶成像系统摄像分析，如基因甲基化特异引物扩增出目的条带则提示SFRP基因甲基化阳性，计算SFRP基因甲基化率。1.2.2HPV感染检测采用实时荧光定量聚合酶链反应法，采用无菌棉签采集子宫颈拭子，洗涤到含1mL生理盐水(武汉益普生物科技有限公司)的离心管中，取100L于离心管中，采用离心机(上海臻诺生物科技有限公司，型号ThermoFisher)10000r/min离
6、心10min，弃上清;采用DNA提取试剂盒(广州健仑生物科技有限公司)提取沉淀细胞中的DNA，以此DNA为模板进行PCR扩增。取一支洁净离心管，分别加入DNA5L、阴性质控品5L、阳性质控品5L，将管盖盖紧，瞬时离心后进行q-PCR扩增。PCR反应条件:95预变性60s,95变性10s、62退火40s、72延伸40s,40个循环，根据Ct值和扩增曲线判断结果，Ct值38判定为HPV感染阳性。1.3统计学方法本研究数据的统计分析在SPSS22.0软件上进行，组间计数资料采用均数标准差表示，数据比较采用t检验;计数资料以百分比(%)表示，数据比较采用2检验。采用Spearman相关分析SFRP基因
7、甲基化率与子宫颈鳞状细胞癌患者临床病理特征及HPV感染的相关性，P0.05表示差异具有统计学意义。2、结果2.1子宫颈鳞状细胞癌组织及癌旁正常组织中SFRP基因甲基化率结果显示，子宫颈鳞状细胞癌组织中SFRP基因甲基化率高于配对癌旁正常组织，差异具有统计学意义(P0.05);不同WHO病理分级、FIGO分期的子宫颈鳞状细胞癌患者癌组织SFRP基因甲基化率比较，差异具有统计学意义(P0.05)。见表2。表1子宫颈鳞状细胞癌组织及癌旁正常组织中SFRP基因甲基化率比较表2不同临床病理特征的子宫颈鳞状细胞癌患者癌组织SFRP基因甲基化率2.3HPV感染子宫颈鳞状细胞癌患者癌组织SFRP基因甲基化率结
8、果显示，HPV感染阳性子宫颈鳞状细胞癌患者SFRP基因甲基化率高于HPV感染阴性子宫颈鳞状细胞癌患者，差异具有统计学意义(P0.05)，与子宫颈鳞状细胞癌患者WHO病理分级、FIGO分期、HPV感染呈正相关(P0.05)，不同WHO病理分级、FIGO分期的子宫颈鳞状细胞癌患者SFRP基因甲基化率差异有统计学意义(P0.05)，并且子宫颈鳞状细胞癌患者SFRP基因甲基化与WHO病理分级、FIGO分期呈正相关，提示SFRP基因甲基化与子宫颈鳞状细胞癌恶性进展有一定关系。进一步研究发现HPV感染阳性子宫颈鳞状细胞癌患者SFRP基因甲基化率高于HPV感染阴性子宫颈鳞状细胞癌患者，并且子宫颈鳞状细胞癌患
9、者SFRP基因甲基化与HPV感染呈正相关，提示SFRP基因甲基化的子宫颈鳞状细胞癌患者发生HPV感染的可能性越大。综上所述，子宫颈鳞状细胞癌患者SFRP基因甲基化与患者的WHO病理分级、FIGO分期、HPV感染呈正相关，SFRP有望成为子宫颈鳞状细胞癌诊断的生物标志物。但本研究纳入病例数不足，有待进一步加大样本量及多中心研究。参考文献:1王稳,伏世杰,张师前.2017ESMO子宫颈癌临床实践指南:诊断治疗和随访解读J.医学综述,2018,12(10):2345-2348.9戴永刚,张乃馨,穆家康.HPV亚型与子子宫颈癌前病变及癌变的关系研究J.中国肿瘤临床与康复,2018,2(6):8756-
10、8757.13钟焱,徐慧,彭凤兰.DNA甲基化在基因表达调控中的意义及研究进展J.中国医药导报,2019,4(14):33-36.14沙英娇,何赏,王成彬.非小细胞肺癌DNA甲基化研究进展J.中华检验医学杂志,2017,40(6):475-477.17郭玉霞,马利国,陈递林,等.Wnt信号通路成分相关因子在卵巢癌中的表达以及临床预后价值J.山西医药杂志,2018,47(13):1245-1247.18刘学刚,刘艳彩,吴春平,等.CD151对结肠癌中Wnt信号通路变化的影响J.中国医药导报,2018,15(16):8765-8767.徐志红,邓莹.子宫颈鳞状细胞癌患者SFRP基因甲基化与临床病理特征及HPV感染的关系J.贵州医科大学学报,2020,45(10):1214-1218.基金:四川省卫生厅科研课题(130439).
