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1、第一章1、基因工程：是通过对基因的操作来定向改变或修饰生物体或人类自身，并具有明确应用目的的活动。被操作的对象一般会发生遗传信息或遗传改善的变化，并具有稳定的遗传性。2、供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。3、基因工程的工具有哪些？P7（1）基因操作的车间大肠杆菌Escherichiacoli和病毒（2）获得基因片段的工具限制性核酸内切酶（3）连接基因片段的工具连接酶（4）基因操作的载体质粒和病毒第二章连接酶只能封闭缺口(nick),不能连接裂口(gap)。限制性内切酶造成粘性末端, 有利于重组DNA分子的构建4、限制性内切酶的概念：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序
2、列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。分子克隆工具酶：限制性内切酶、甲基化酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、连接酶、磷酸激酶和磷酸酶5、命名方法：限制性内切酶的命名属名 种名 株名Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株H i n d III H i n d III同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶6、限制与修饰系统的种类：根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统可分为三类(I,II,III)，也可分为四类(多了一个IIs,即II亚类)。一般所说的限制酶，特指II型限制酶，因为只有这一类具有使用价值。7、各种限制与修饰系统的比较
3、 型限制与修饰系统所占比例最大，达93%限制酶产生的末端1.产生匹配的黏末端回文对称序列，内部切割，产生的末端相同且互补2.产生非对称突出末端切割序列为非对称序列，产生非对称的突出末端3.平末端切割回文对称序列，产生平末端 5黏末端和3黏末端8、同尾酶、同裂酶和归位内切酶的末端判断 同裂酶来源不同，识别相同的序列（1）同序同切酶识别序列和切割位置都相同 Hind与Hinc识别切割位点为GTYRAC Hpa与Hap识别切割位点为CCGG Mob与Sau3A识别切割位点为GATC 有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同（2）同序异切酶识别序列相同，切割位置不同 Kpn： GGTACC Acc65：GG
4、TACC Asp718：GGTACC（3）同功多位识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能 EcoR：GAATTC Apo： RAATTY Hpa： GTTAAC Hinc：GTYRAC（4）其他限制酶识别序列相互交叉 Sal：GTCGAC Acc：GTMKAC Hinc： GTYRAC 5.同尾酶来源不同，识别序列不同，但产生黏末端相同5-GGATCC-33-CCTAGG-5BamH5-TGATCA-33-ACTAGT-5Bcl5-AGATCT-33-TCTAGA-5Bgl产生相同的5GATC粘性末端 杂种位点（hybridsite）由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。 一
5、般不能被原来的任何一种同尾酶识别。 BamH：G GATCCBcl：T GATC A C CTAG GA CTAG T 杂种位点：GATC C（BamH） CTAG T（Bcl）经同尾酶消化的DNA末端连接示意图省略 BamH I Bgl II 6.归位内切酶Iprefix和pIprefix系列酶有些线粒体、叶绿体、核DNA、T偶数噬菌体含有一些编码内切酶的内含子，有些intein（proteinsplicingelement）也有内切酶的活性，这两类内切核酸酶称为Iprefix和pIprefix系列内切酶，它们识别的序列很长。 Iprefix是由在RNA水平上剪切和编码的 pIprefix在
6、蛋白质水平上剪切的产物。 9、位点偏爱：某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。某些噬菌体DNA中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性是不同 EcoR：5个位点，并不是随机切割，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍 Sac：三个在中央，一个在右臂，对中央三个位点的酶切速度快50倍 原因:切割DNA之前需要同时与两个识别位点作用 Nar，Nae和Sac切割DNA要求作用的DNA序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个是为DNA切割激活另一个的变构位点（allosteric） BspM、EcoR和Hpa10、酶切反应条
7、件 1.缓冲液常规缓冲液一般包括提供稳定pH值的缓冲剂、Mg+、DTT（二硫苏糖醇）以及BSA（小牛血请白蛋白）。2.反应温度大多数为37，一部分为5065，少数2530高温作用酶在37下的活性会下降，多数仅为最适条件下的1050% 3.反应时间反应时间通常为1小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量 EcoR若反应16小时，所需酶量为正常酶切时间的1/8 Hind为1/8；Kpn为1/4；BamH为1/2 终止酶切的方法 EDTA可鏊合镁离子，从而可终止酶切反应，终止浓度为10mM加热是常用的方法，对于最佳反应温度为37的酶，在65或80处理20分钟可使酶活性大部分丧失但是对于在80作用
8、20分钟也有不失活的酶，如Bg1、Hpa和Pvu；Tth111和TspR，以及Bc1，可用苯酚抽提去除蛋白，或用试剂盒纯化DNA11、星星活性概念：星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点12、甲基化酶的种类原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。在 E.coli 中，大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶 12、甲基化酶的种类：1Dam 甲基化酶 Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。有些限制酶对 Dam 甲基化的 DNA 敏感，不能切割相应的序列，如 Bcl、
9、Cla、 Xba 等。对甲基化不敏感的有 BamH、 Sau3A、 Bgl、Pvu 等。Mbo 和 Sau3A 识别和切割位点相同，但其差异就在于前者对甲基化敏感。一般哺乳动物 DNA 不会在腺嘌呤 N6 上甲基化，因此对甲基化敏感的限制酶切割这些 DNA不会受到影响。2Dcm 甲基化酶 Dcm 甲基化酶识别 CCAGG 或 CCTGG 序列，在第二个胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基。受 Dcm 甲基化作用影响的酶有 EcoR(CCWGG)。大多数情况下，其同裂酶 BstN(CCWGG)可避免这一响，因为二者识别序列虽然相同，但切点不同。3EcoK 甲基化酶。EcoK 甲基化酶的识别位点少
10、，识别 AAC（N）6GTGC 和 GCAC（N）6GTT 序列中 A 的 N6 位置。但因为识别位点少（1/8kb），所以研究较少。甲基化对限制酶切割反应的影响：1修饰酶切位点2产生新的酶切位点3对基因组作图的影响第3节 DNA聚合酶：1、大肠杆菌DNA聚合酶 2、KlenowDNA聚合酶 3、反转录酶13、DNA聚合酶的各种类的活性：DNA聚合酶催化以DNA为模板合成DNA的反应。特点: 以dNTPs作底物；有模板存在；有引物存在；新链合成方向为53。大肠杆菌有三种DNA聚合酶。一、E.coli DNA聚合酶I 1.大肠杆菌DNA聚合酶的活性(1)53聚合酶活性：(2)53外切酶活性(3)
11、35外切酶活性 2. 大肠杆菌DNA聚合酶的用途切口平移法制备探针二、Klenow DNA聚合酶Klenow片段是大肠杆菌聚合酶全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段肽段，分子量为76kD。活性:53的聚合酶活性、35的核酸外切酶活性. 补平DNA的3凹端.抹平DNA的3凸端.通过置换反应对DNA进行末端标记.随机引物标记.在cDNA克隆中合成第二链；在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA三、反转录酶反转录酶即依赖于RNA的DNA聚合酶。它来自AMV(禽成髓细胞瘤病毒)或 Mo-MLV(Moloney 鼠白血病病毒，又称M-MuLV )。活性：依赖于RNA的DNA聚合酶活性：可以有效地将m
12、RNA反转录成DNA，其产物称为cDNA(complementary DNA)；RNase H活性：水解DNA-RNA杂合链中的RNA分子；依赖于DNA的DNA聚合酶活性。主要用途是 将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。.14、限制性内切酶切割DNA后产生的末端有哪些类型？限制酶在识别序列内部切割DNA分子，可产生3种不同的末端：平末端，5-突出末端，3-突出末端。 (一) 平末端 Hae (GGCC) EcoRV (GATATC) (二) 粘性末端 大多数限制酶交错切割DNA双链，产生5-突出末端或3-突出末端。15、连接酶的功能：(1)能封闭DNA双链或RNA/DNA杂种双链中的单链缺
13、口，而不能封闭双链RNA中的单链缺口(2)能封闭粘性末端退火后出现的缺口；用途：(1)通过粘端连接DNA分子；(2)连接平端双链DNA分子或平端DNA与人工接头的连接。T4连接酶反应底物为粘端、切口、平末端的RNA（效率低）或DNAT4 DNA连接酶包括分子间连接和分子内连接由T4噬菌体产生，以ATP作为辅助因子。可修复双链DNA上的单链缺口；连接RNADNA杂交双链上的DNA链缺口或RNA链缺口；连接完全断开的两个平头末端DNA分子。是基因工程中最常用的连接酶，可以从厂家直接购买。连接反应最佳温度为37，但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI 粘性末端连
14、接部位只有4个碱基对，很容易断开。所以通常在416 连接。影响连接效率的因素有：A.温度B.ATP的浓度C.连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）D.反应时间（通常连接过夜）E.插入片段和载体片段的摩尔比平末端DNA之间的连接。平末端DNA之间也可用T4 DNA连接酶连接，但反应速度要慢得多。加大酶和底物的浓度，或者加入适量的一价阳离子(Na+)和低浓度的PEG，从而提高T4 DNA连接酶的连接效率。大肠杆菌DNA连接酶所连接的是粘性末端，平末端效率低P3416、碱性磷酸酶的用途：防止载体。自连其主要用途有：在用32P标记DNA 5端之前，去除5端的磷酸；在DNA重组技术中，去除DNA片段的5磷酸，防止载体的自身环化，提高重组子比例。第三章供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。质粒(Plasmid)是染色体外的遗传因子，能进行自我复制，多为超螺旋共价、闭合、环状双链DNA(cccDNA)，少数线状。大小1200kb携带多种特殊功能基因。17、质粒的特性质粒(plasmid):独立于染色体外的裸露的双链环DNA分子。常有13个抗药性
