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1、第十七章 医药基因工程n自年重组技术诞生以来，基因工程技术得到飞速发展，并在医疗领域中展露出独特的优越性。基因工程药物就是利用基因工程技术生产的药物。n基因工程药物是将药物蛋白或多肽的编码基因通过特定的受体细胞中，通过受体生物或者细胞表达出药物蛋白或多肽，最后将其纯化并制成药剂的过程。n基因工程药物生产的过程与其他基因工程产品的基本原理是相通的，基本过程都包括了载体构建，工程菌或细胞培养，目的产物的分离纯化与鉴定等。n从年最早的基因工程药物胰岛素上市到年底，已经有多种基因工程药物通过审查并上市，另外还有多种基因工程药物进入二期及三期临床实验，涉及治疗多种疾病。n我国于年批准了第一个基因工程药物
2、重组人干扰素ab的生产，标志着我国基因工程药物生产实现了零的突破。我国药品市场上基因工程药品主要有基因工程乙肝疫苗，重组干扰素，重组人红细胞生成素等种自主开发的基因工程药物。第一节基因工程药物的开发状况一.基因工程药物的分类.按照结构组成不同分类：蛋白多肽类药物，基因工程疫苗和核酸类药物三类。.按照作用方式分类：基因水平作用药物，转录水平作用药物和蛋白质水平作用药物。.按照药物作用机理分类：其一：蛋白或多肽药物，通过蛋白自身的生理生化特性而抵抗疾病其二：基因工程疫苗，基因工程抗体和疫苗，基于抗原抗体反应的原理而抵抗疾病其三：反义核酸，核酶和i，基于中断基因表达而抵抗疾病。二.基因工程药物的发展
3、.反应器的变迁根据反应器的不同可将蛋白多肽类基因工程药物的发展分为三个阶段：a.早期大多数蛋白多肽类基因工程药物通过细菌和酵母等微生物来表达。b.后来发展了真核生物细胞表达系统，利用离体培养的昆虫细胞和脊椎动物（如哺乳动物和鸟类）细胞表达蛋白多肽类药物。c.近年来发展的动植物生物反应器为基因工程药物的开发带来美好的前途。.从基因工程到蛋白质工程随着技术的进步，人们通过蛋白质工程可获得修改了氨基酸序列的蛋白质或多肽。通过定点突变、功能域的交换、分子进化等手段，已经开发了一些活性提高、适应性改善和专一性增强的蛋白药物。.从蛋白药物到核酸药物传统药物是通过增加某些人体内源性的有益蛋白多肽或者破坏致病
4、蛋白本身来治疗疾病；而核酸类基因工程药物则是提供产生蛋白的基因，通过破坏或者扩大基因的功能来克服疾病。基因工程药物的开发关键在于探知什么蛋白或多肽、或核酸可以成为药物，已经通过什么样的方式制备药物或通过什么样的方式使用药物。三.基因工程药物的产业化状况n第一个基因工程药物基因工程人胰岛素的问世期间经历了不到十年。n至年第一个以基因工程制药为对象的美国enentech公司成立以来，有药物进入临床实验的生物技术公司已有约个。n在年，超过种基因工程药物获准在美国和欧盟使用，中正在进行临床实验，市场份额超过亿美元。n我国共有种基因工程药物和疫苗，其中种为具有自主知识产权的”一类“新药，进入临床研究的大
5、约有种，销售收入超过亿人民币。n表第二节基因工程蛋白和多肽药物一.基因工程胰岛素.胰岛素与糖尿病胰岛素（insulin）是一种激素，能够调节糖代谢，促进葡萄糖转变为糖原并储存于肌肉和肝内。当人体胰腺的细胞不能产生足量的胰岛素时，就会导致人体内的葡萄糖浓度增高，并伴随因胰岛素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱，即糖尿病。而对于胰岛功能完全消失的型糖尿病患者，不注射胰岛素就无法维持生命。.胰岛素的结构n胰岛素是一种由两条多肽链（链和链）组成的蛋白质。链含有个氨基酸，链含有个氨基酸，链间通过二硫键结合。n胰岛素在人体内合成的过程中首先合成前胰岛素原（preproinsulin），包括信号肽
6、序列、链、链和连接序列个部分。n胰岛素是经过去掉信号肽序列后形成胰岛素原，去掉连接序列后剩下的链和链通过二硫键结合，形成了胰岛素。（图）.基因工程胰岛素的生产方式主要有两种生产方式：a.利用大肠杆菌为受体，分别表达胰岛素链和链，再分别提取和纯化产生的链和链，最后利用化学方法使两条链之间形成二硫键，从而得到胰岛素。b.以酵母为受体分泌表达人胰岛素。在胰岛素编码基因前段增加一个信号肽编码序列，这个信号肽引导合成的胰岛素从细胞内分泌到周围的培养基中，从而简化了胰岛素的纯化过程，最后通过酶学反应使之变成人胰岛素。二.基因工程人红细胞生成素.人红细胞生成素的组成和生物活性成熟的人红细胞生成素（）是一种由
7、个氨基酸组成的糖蛋白，多肽结构中由个半胱氨酸形成条二硫键，相对分子质量为又称促红细胞生成素或红细胞生产刺激因子，是一类造血生长因子，刺激和调节哺乳动物红细胞的生成，维持外周血红细胞处于正常水平。肾是产生的主要器官，目前只有应用基因工程技术生产才能满足患者的需求。.重组红细胞生成素的生产n人类位于第号染色体长区，年克隆到其c。由于糖基化的问题，目前只利用脊椎动物表达系统来生产人红细胞生成素，其糖基化特性与人体中自然产生的糖基化特性最相近。n方法：通过将编码人红细胞生成素的基因装入哺乳动物细胞表达载体，转染二氢叶酸还原酶缺陷的细胞（dhfr）株，并进一步筛选获得高产人红细胞生成素的。经过一系列细胞
8、培养和蛋白质纯化等工艺制备过程，产生有生物学活性的重组人。n现在上市的红细胞生成素主流产品都是通过基因重组技术，利用中国仓鼠卵巢细胞（hinesehamsterovary，）生产的。三.基因工程干扰素.干扰素的结构组成、生物活性和临床应用干扰素（interferon，）是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白细胞因子，最早于年发现。干扰素是一类多功能细胞因子，按其结构和功能的差异可以分为三类，即干扰素 、干扰素和干扰素。干扰素 含有种不同的亚型，干扰素和干扰素都只有种亚型。干扰素的成熟产物由个氨基酸组成，其中含个半胱氨酸，形成对生物活性至关重要的个二硫键。干扰素主要由白细胞、淋
9、巴细胞、成纤维细胞和一些肿瘤细胞分泌；临床上主要用来治疗白血病，以及一些慢性病毒，如乙型肝炎、丙型肝炎和疱疹病毒感染。2.基因工程干扰素的生产n早期制备是通过诱导或重组诱导天然或人工培养的人体细胞或血细胞产生天然干扰素。n利用基因工程生产干扰素：a.先要获得干扰素的编码基因；b.利用诱生剂诱导细胞表达干扰素；c.然后提取干扰素的m，反转录成c；d.将干扰素编码基因通过合适的表达载体，导入大肠杆菌进行表达可产生大量干扰素；e.经过分离纯化便可制成药物制剂。四、基因工程疫苗疫苗的定义：由灭活或减毒的病原体做成的可预防相应病原物引起疾病的药物，通过接种人或动物在其体内建立抗感染免疫反应而产生保护作用
10、。.基因工程疫苗的分类：a.亚单位疫苗。指用病原体的组分制成的疫苗，包括病毒的结构蛋白和细菌的脱毒毒素蛋白，其中病毒的结构蛋白是指病毒组成成分中能引起人体对病毒颗粒产生免疫反应且不致病的蛋白组分；细菌脱毒毒素蛋白是利用重组技术在基因水平上对细菌的毒素蛋白进行脱毒所获得的基因工程疫苗。b.无毒疫苗或减毒活疫苗。利用重组技术去掉致病菌的毒素基因后得到的即保留了其侵入细胞和刺激免疫系统的能力，却又不能引起疾病的减毒病原菌。c.疫苗载体。把目的基因转到已经在临床上使用的安全的活疫苗中，利用该活疫苗作为载体表达目的抗原基因，从而达到针对某种传染病的免疫保护作用。.重组乙型肝炎疫苗n乙型肝炎的定义：由乙型
11、肝炎病毒（）引起的、以肝为主要病变并可累及多器官损害的一种传染病。n乙型肝炎病毒颗粒由囊膜和含有分子的核衣壳组成，又称ane颗粒。n最初的乙型肝炎疫苗都是血液乙型肝炎疫苗，是从乙型肝炎患者血液中分离提取乙型肝炎表面抗原（sg）。疫苗的制备一般选定具有免疫原性的乙型肝炎表面抗原基因片段，将起插入表达载体，并引入到与表达载体相对应的宿主细胞，构成重组体。重组体像一个加工厂，可以表达、加工、生产出乙型肝炎表面抗原，即得到基因工程疫苗。（）.重组酵母乙型肝炎疫苗n用来表达抗原的酵母主要是酿酒酵母、汉逊酵母和毕赤酵母。n表达质粒上用来在酵母中表达sg的主要部件有个：在酵母中表达sg 的启动子。不含有内含
12、子的乙型肝炎病毒sg 的基因。在酵母细胞中终止sg转录的序列。n利用酵母细胞表达sg存在缺点：酵母细胞不能分泌sg 颗粒；酵母细胞对sg 蛋白的糖激化与哺乳动物的不同，使得获得的酵母sg 可能具有与血液sg 不同的免疫原性；在酵母中装配nmsg 颗粒不稳定；酵母细胞产生的sg需要化学方法处理才能与血液的sg相同，在这过程中可能改变sg分子的结构，从而减小sg抗原性。（）.重组中国仓鼠卵巢细胞（）乙型肝炎疫苗n将乙型肝炎表面抗原基因片段重组到中国仓鼠卵巢细胞（）内，通过对细胞的培养增殖，分泌乙型表面抗原（sg ）于培养液中，经纯化，加佐剂氢氧化铝后制成疫苗。n优点：乙型肝炎疫苗产生的sg的糖基化
13、与血液颗粒的糖基化一样；产生的sg颗粒是以自然方式装配的，而不需要其他的化学处理；装配的nmsg颗粒最后会被分泌到培养基中，不需要裂解细胞，简化了纯化步骤；成本不高，有利于那些负担不起现有的高价疫苗的患者。五.基因工程抗体n抗体的定义：是机体受抗原刺激后由淋巴细胞产生，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白，是体液免疫应答中发挥免疫功能的最主要的免疫分子，主要分布与血清中，在组织液和外分泌液中也存在。常规抗体是针对多种不同抗原决定蔟产生的抗体，又称多克隆抗体；而针对某种抗原决定蔟的抗体称单克隆抗体，一般由杂交瘤细胞分泌。n在临床上，抗体可用于抗肿瘤、抗感染、抗器官移植排斥反应、抗血
14、栓形成和解毒，以及构建独特型疫苗、治疗自身免疫性疾病和变态反应疾病，此外还可用于体外诊断和发挥体内药物导向作用。基因工程抗体在临床上可发挥更多更重要的作用。第三节基因工程抗体一.抗体的结构n抗体分子是由条多肽链组成的四聚体，即由条相同的轻链（）和条相同的重链（）组成，重链之间以及轻链之间通过二硫键连接，呈字型结构（图）。n重链由个氨基酸组成（如抗体g），轻链由个氨基酸组成，完整抗体的相对分子质量约为。抗原的识别位点位于轻链和重链的端区域，该区称称作抗体的可变区（区），识别位点就在区内的个互补决定区（），也称超变区，每个长约个氨基酸。n区以外的部分称为框架区（），其氨基酸序列相对保守，不与抗原分
15、子直接结合，可维持抗体的空间构型。n抗体分子含有多个功能区，除区外，每一条轻链含有个保守区（区），每一个重链含有个保守区（、）。二.天然抗体的局限性n抗原有多种不同抗原决定蔟，可刺激产生多克隆抗体。这种抗原是不均一的，会影响检测抗原的特异性及敏感性，在临床上应用受到很大限制。n单克隆抗体的定义：是由识别一种抗原决定蔟的细胞克隆所产生的均一抗体，可视为第二代抗体，具高度特异性、均一性，且亲和力强、效价高，在临床上发挥了重要作用。n单克隆抗体在临床中的问题：单克隆抗体具有免疫原性；杂交瘤制备的单克隆抗体在人体内的半衰期只有h，不利于药效发挥作用；吸收差，抗体相对分子质量大，很难通过血管进入细胞间隙
16、，大大降低治疗效果；生产复杂，价格较高。三.基因工程抗体的种类.单克隆抗体的人源化为了解决鼠源抗体的免疫原性问题，应改造抗体，构建人鼠嵌合抗体和人源化抗体。a.人鼠嵌合抗体通过基因重组，将鼠源单克隆抗体的v片段替换人源抗体的相应片段，制成人鼠嵌合抗体（图）。序列来自人源抗体，序列来自鼠源抗体；可保留抗体的特异性结合位点，也可减弱其免疫原性。b.人源化抗体是对嵌合抗体进一步改进的结果，即用鼠源单克隆抗体的所获得的杂合抗体，序列来自人源抗体，的序列来自鼠源抗体，最大限度地使鼠源抗体人源化（图）。抗体的抗原结合特性保留，在人体内产生免役原性的程度降到最低。 .小分子抗体为了解决穿透性问题，对抗体改造，保留抗原结合位点，成为小分子抗体，分为下面种：a.ab抗体抗体的ab片段由重链的区和m区与轻链以二硫键相连，能发挥抗体的抗原结合功能，大小为完整抗体的。b.单链抗体将抗体的和用连接肽连接，形成具有抗原结合能力的单链抗体多肽，即所谓的单链抗体（cv）。其大小仅为完整抗体的，免疫原性弱，药物动力学优于ab片段和完整抗体，能有效到达完整抗体无法达到的靶部位。c.单域抗体抗体结合抗原的部位主要在区，只含
