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1、核酸分子杂交第六章Nucleic acid hybridization*1授课：广东医科大学授课：广东医科大学 林小聪林小聪*2 指含有一部分互补序列、分子来源不同的核苷指含有一部分互补序列、分子来源不同的核苷酸单链，在一定条件下按照酸单链，在一定条件下按照碱基互补配对的原则碱基互补配对的原则，形成核苷酸双链的过程。形成核苷酸双链的过程。核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic (nucleic acid acid hybridization)hybridization)印迹印迹(blotting)(blotting) 指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的
2、生物大分子转移到分子转移到硝基纤维膜等硝基纤维膜等特定的支持物特定的支持物上上，使之成，使之成为固相化分子的过程。为固相化分子的过程。*3 核酸杂交技术的理论基础：DNA变性复性现象。 第一节 核酸探针及其标记核酸探针(probe)的概念： 用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA的标记互补片段： 与待测特定核苷酸的某一段序列互补； 有明确的标志用于后续的检测。*4*5探针的种类寡核苷酸探针基因组DNA探针cDNA探针RNA探针 一 探针的种类及其选择DNA探针*61基因组DNA探针双链探针:单链探针 采用PCR技术将各种克隆在质粒载体中的特异性基因片段扩增、标记制备而成。 用化学
3、法合成或从克隆在M13噬菌体的特异性基因片段制备。*72cDNA探针 提取mRNA，经反转录cDNA，再经cDNA克隆或PCR扩增、标记而制备成cDNA探针。3RNA探针 通常采用含T7或SP6启动子的表达载体来制备高度敏感的RNA探针。*8 将目的基因克隆到含T7或SP6启动子的表达载体的MCS中，用适当的内切酶在插入序列的下游切割而成的线性载体作为模板，加入T7或SP6 RNA聚合酶、NTPs、和标记-dUTP,即可制备出高度敏感的RNA探针。4寡核苷酸探针 采用DNA合成仪人工合成、标记制备。 二 核酸标记物及其选择核酸探针的标记可分为放射性标记和非放射性标记；根据标记物掺入情况可分为均
4、匀标记和末端标记探针。不影响碱基对特异性理想标记物应备条件高度灵敏性有较高的化学稳定性高度特异性检且不影响与目标DNA结合不影响标记用酶的活性标记及检测方法简单环保，无损害*9优点缺点灵敏度和特异性极高半衰期短, 随用随标(一)放射性核素对各种酶促反应无任何影响不影响碱基配对的特异性与稳定性放射性污染 用于核酸探针标记的放射性核素主要有32P、35S和3H等；32P应用最多。*10(二)非放射性标记物优点缺点灵敏度较放射性核素标记略低无放射性污染 用于核酸探针标记的非放射性标记物主要有生物素、地高辛、荧光素(FITC、罗丹明)和酶等。稳定性好,可较长时间存放特异性较放射性核素标记低*11*12
5、The method used to produce nonradioactive DNA molecules carried a specific chemical marker could be detected with an appropriate antibody or avidin.biotin-avidin systemDig-dUTP1.地高辛和生物素 用一种用一种标记核苷酸标记核苷酸代替原料代替原料dNTPsdNTPs中对应的中对应的非标非标记核苷酸记核苷酸，使，使标记核苷酸标记核苷酸掺入到合成新链中掺入到合成新链中。Dig-dUTPUU 别名：别名：Vitamin Vita
6、min H H 分子量：分子量：244.31244.31 水溶性好水溶性好关于生物素（Biotin）结合对象：结合对象： 亲和素亲和素AvidinAvidin 链亲和素链亲和素StreptavidinStreptavidin 中性亲和素中性亲和素NeutrAvidin NeutrAvidin 单体亲和素单体亲和素Mono Mono AvidinAvidin *14 当双链当双链DNADNA一条链上有切口时，一条链上有切口时，E.coliE.coli DNADNA聚合聚合酶酶的的5533的外切酶活性的外切酶活性能从切口的能从切口的55端除去核苷端除去核苷酸；同时，酸；同时，5533聚合酶活性聚合
7、酶活性可将核苷酸连接到切可将核苷酸连接到切口的口的33羟基末端；使切口沿着羟基末端；使切口沿着DNADNA链移动。链移动。(一) DNA切口平移(nick translation)(nick translation) 标记法*15 三、核酸探针标记的主要方法 用一种用一种标记核苷酸标记核苷酸代替原料代替原料dNTPsdNTPs中对应的中对应的非标非标记核苷酸记核苷酸，使，使标记核苷酸标记核苷酸掺入到合成新链中掺入到合成新链中。思考题13355335533555533聚合酶活性聚合酶活性3355外切酶活性外切酶活性5533外切酶活性外切酶活性DNA酶：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3
8、-OH端。大肠杆菌DNA聚合酶：53 DNA聚合酶活性； 53 外切核酸酶活性。DNA切口平移标记法示意图*16 最适切口平移的片段一般为最适切口平移的片段一般为50-50050-500个核苷酸。个核苷酸。 使使寡核苷酸随机引物寡核苷酸随机引物与与DNADNA模板结合，在模板结合，在KlenowKlenow酶的作用下，合成酶的作用下，合成DNADNA探针；探针；(二) DNA随机引物标记法*17 用一种用一种标记核苷酸标记核苷酸代替原料核苷酸中对应的代替原料核苷酸中对应的非非标记核苷酸标记核苷酸，使，使标记核苷酸标记核苷酸掺入到合成新链中掺入到合成新链中。 KlenowKlenow片段没有片段
9、没有5353外切酶活性，反应稳定，可外切酶活性，反应稳定，可 以获得大量的有效探针；以获得大量的有效探针；随机引物：含有各种可能排列顺序的6聚寡核苷酸片段的混合物。（46=4096种）DNA聚合酶Klenow片段：保留53 DNA聚合酶活性,弱35外切酶活性，无53外切酶活性。DNA随机引物标记法示意图*18 通常，产物平均长度为通常，产物平均长度为400-600400-600个核苷酸。个核苷酸。Bio-5 3 3 5 完整双链DNA限制性内切酶5 3 3 5 Bio-dNTP其他3 种dNTPsKlenow 聚合酶5 3 3 5 变性5 3 3 5 5 末端突出的DNA3 末端标记的DNA末
10、端标记的单链DNA探针1. DNA的3末端标记(三) DNA探针的末端标记*19Dig-dUTP 用一种用一种标记核苷酸标记核苷酸代替原料核苷酸中对应的代替原料核苷酸中对应的非非标记核苷酸标记核苷酸，使，使标记核苷酸标记核苷酸掺入到合成新链中掺入到合成新链中。u核酸探针标记的其它方法(一) DNA切口平移标记法(二) DNA随机引物标记法(七)单链DNA探针的标记(三)末端标记1：3 DNA末端标记法(四) RNA探针的标记(五) cDNA探针的标记(六)寡核苷酸探针的标记*21u核酸探针标记的主要方法(三)末端标记2： 5 DNA的末端标记 四、标记探针的纯化凝胶过滤层析 常用的商品凝胶基质
11、是Sephadex G-50和Bio-Gel P-60，所获的探针长度一般大于100nt。选择性沉淀 反复使用乙醇沉淀；2mol/L醋酸铵 和乙醇的沉淀效果更好。*22 第二节第二节 SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交 SouthernSouthern印迹杂交（印迹杂交（Southern blottingSouthern blotting）是指）是指DNADNA与与DNADNA分子之间的杂交。分子之间的杂交。基本过程基本过程: : 将琼脂糖凝胶电泳分离的待测将琼脂糖凝胶电泳分离的待测DNADNA片段变性，再片段变性，再将凝胶中的将凝胶中的DNADNA分子转移到分子转移到硝基纤维膜
12、等硝基纤维膜等固相支持物固相支持物上，然后用标记的探针检测待测的上，然后用标记的探针检测待测的DNADNA。 可用于基因组可用于基因组DNADNA的定性与定量分析，重组质粒的定性与定量分析，重组质粒和噬菌体的分析等。和噬菌体的分析等。*23一、固定支持物与印迹方法的选择*24 1975年，Edwen Southern建立的DNA印迹： 印迹转移的方法有毛细作用转移、电转移和真空负压吸引转移支持物转移缓冲液纸巾玻璃板500gWhatman滤纸凝胶Whatman滤纸重物NC膜或尼龙膜*25限制性内切酶消化限制性内切酶消化酶切酶切DNADNA样品的电泳分离样品的电泳分离凝胶中凝胶中DNADNA的的N
13、aOHNaOH变性变性凝胶中凝胶中DNADNA分离带分离带SouthernSouthern印迹印迹凝胶中凝胶中DNADNA带被带被转移到转移到NCNC膜上膜上标记探标记探针杂交针杂交探针杂交带曝光显影 二、二、SouthernSouthern印迹杂交的基本过程印迹杂交的基本过程HRPHRP标记抗标记抗体与体与DigDig结合结合漂洗和漂洗和封闭封闭Y YHRPHRPHRPHRPHRPHRP底物与抗体底物与抗体-HRP-HRP反应反应, , 显色或发光显色或发光底物底物 电泳,转膜，紫外交联固定DD North-South North-South 杂交原理和操作流程杂交原理和操作流程( (地高辛
14、标记地高辛标记) )杂交：杂交：DigDig标记的探针与标记的探针与靶靶DNADNA结合结合*27 用无关的单链DNA，如小牛胸腺DNA或鲑鱼精子DNA预杂交。思考题21.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记， 保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上X光片，曝光1-5 分钟；2.显影：取出X光片，按使用说明书显影和定影。化学发光检测 Luminol化学发光原理 *28 North-South North-South 杂交原理和操作流程杂交原理和操作流程( (BiotinBiotin标记标记) )杂交：生物素标记的探针与靶DNA结合底物在HRP催化下,反应发光洗膜封闭电泳,转膜，紫外交联固定SAHR
15、P底物BBHRP标记的链亲和素与探针上的生物素结合*29 第三节第三节 NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交 利用类似于利用类似于SouthernSouthern印迹印迹杂交的技术来杂交的技术来检测检测RNARNA称为称为NorthernNorthern印迹杂交（印迹杂交（Northern Northern blottingblotting）。）。 原理和过程与原理和过程与SouthernSouthern印印迹基本相同，只是检测的分子迹基本相同，只是检测的分子是是RNARNA，可用来对组织或细胞中，可用来对组织或细胞中的的mRNAmRNA进行定性或定量分析。进行定性或定量分析。 *
16、30Northern Northern 与与Southern blottingSouthern blotting的异同的异同点点相同点：相同点： 原理均为毛细作用原理均为毛细作用 用途：用途：检测组织或细胞中已知的特异检测组织或细胞中已知的特异mRNAmRNA的表达水平；的表达水平；比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。不同点：不同点：转移的是转移的是RNARNA转移前无需酶切转移前无需酶切转移效率较高转移效率较高变性方法变性方法: DNA(: DNA(碱变性）碱变性） RNARNA（甲醛、乙二醛等）（甲醛、乙二醛等）*31 一、斑点杂交与狭缝印迹杂交一、斑点杂交与狭缝印迹杂交 将DNA或RNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上，再采用特定的探针进行杂交，称为斑点印迹。简便、快速，可以在同一张膜上进行多个样品的检测。*3296孔斑点印迹转印系统 第四节第四节 其他核酸分子杂交方法其他核酸分子杂交方法Slot-blot结果GS-670型光密度扫描仪(Bio-Rad) *33 是直接用荧光标记的核酸探针与组织切片或细胞涂片中的目标基因进行杂交的方法。
