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1、第十五章 核酸的研究方法.1、核酸的分离、提纯和定量测定. DNA的分离 RNA的分离 核酸的定量.Isolation of Nucleic AcidsGoals: removal of proteins DNA vs RNA isolation of a specific type of nucleic acidTypes of Methods: differential solubility adsorption methods density gradient centrifugationTypes of DNA: genomic (chromosomal) organellar (sa
2、tellite) plasmid (extrachromosomal) phage/viral (ds or ss) complementary (mRNA)General Features: denaturing cell lysis (SDS, alkali, boiling, chaotropic) enzyme treatments protease RNase (DNasefree) DNase (RNasefree).Collection of cellsUse soft brushes to dislodge epithelial cells lining the mouth.
3、Ample cell collection is very critical for success. Whats in Lysis Buffer? Tris buffer to maintain pH of solution so that DNA is stable SDS to dissolve membranes of cell, allowing DNA to be released into solution SDS also denatures proteins, making them more susceptible to protease cleavageLysis buf
4、ferOSOOO-SDSCH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3-.Why add Protease? Protease destroys nuclear proteins that bind DNA, and cytoplasmic enzymes that breakdown and destroy DNA (nucleases) Protease treatment increases the yield of DNA .Adding salt (5M NaCl) Na+ binds to phosphate groups of DN
5、A, neutralizing the electric charge of DNA NaCl allows DNA molecules aggregate instead of repelling each other, making it easier for DNA to precipitate out of solution when alcohol is added.Adding ice cold alcohol DNA cannot dissolve in alcohol The addition of cold alcohol makes the DNA clump togeth
6、er and precipitate out of solution Precipitated DNA molecules appear as long pieces of fluffy, stringy, web-like strands. Microscopic oxygen bubbles “aggregate” or “fuse” together, simultaneously with the DNA precipitation The larger, visible air bubbles act to “lift” the DNA out of solution, from t
7、he aqueous into the organic phaseDNA Precipitation.High MW Genomic DNA IsolationTypical Procedure1 Cell Lysis 0.5% SDS + proteinase K (55o several hours)2 Phenol Extraction gentle rocking several hours3 Ethanol Precipitation4 RNAse followed by proteinase K5 Repeat phenol extraction and EtOH pptPheno
8、l Extraction mix sample with equal volume of sat. phenol soln retain aqueous phase optional chloroform/isoamyl alcohol extraction(s) aqueous phase (nucleic acids) phenol phase (proteins).High MW Genomic DNA IsolationTypical Procedure1 Cell Lysis 0.5% SDS + proteinase K (55o several hours)2 Phenol Ex
9、traction gentle rocking several hours3 Ethanol Precipitation4 RNAse followed by proteinase K5 Repeat Phenol Extraction and EtOH pptEtOH Precipitation 22.5 volumes EtOH, 20o high salt, pH 55.5 centrifuge or spool out.Isolation of RNASpecial Considerations RNAse inhibitors! extraction in guanidine sal
10、ts phenol extractions at pH 56 (pH 8 for DNA) treatment with RNasefree DNase selective precipitation of high MW forms (rRNA, mRNA) with LiCl oligodT column.2、核酸的沉降特性. 通常很难分离出完整DNA分子，但可得到分子量不太大的环状DNA，这类制剂包括： 共价闭环DNA：常呈超螺旋型 开环DNA：双链环状DNA的一条链断裂，分子呈松弛态 线型DNA：环状DNA的双链断开. 在超速离心机造成的离心力场中，溶液中的核酸下沉的速率会大大加快，这
11、是核酸的沉降特性，该技术可研究： 核酸在溶液中的构象 测定核酸的沉降系数和相对分子量.氯化铯密度梯度沉降平衡超离心法 核酸密度测定 测定DNA中G-C之含量 溶液中核酸构象的研究 用于核酸的制备.Density Gradient Centrifugation rate zonal/sucrose (size fractionation) electrophoresis more common isopycnic/CsCl (density) DNA 1.7 g/cm3 protein 1.3 g/cm3 RNA DNA ssDNA dsDNA GC content20406080% GC ba
12、se pairs1.681.701.721.74density (g/cm3).CsCl GradientsApplications large scale preparations high purity satellite DNA RNA cushionsCsCl Gradients.三、核酸的凝胶电泳.凝胶电泳兼有分子筛和电泳的双重效果不纯核酸样品： 琼脂糖凝胶电泳分离出区带 溴化乙锭染色 紫外灯下粗略估计含量.电泳迁移率取决于： 核酸分子大小 胶浓度 DNA的构象 电流 碱基组成 温度.凝胶电泳的样品可进行回收. 聚丙烯酰胺作为支持物 孔径小于丙烯酰胺 可分析小于1000bp的DNA片
13、断聚丙烯酰胺凝胶电泳.4、核酸的核苷酸序列测定.DNA一级结构的测定 Sanger发明的末端终止法 M. Maxam和W. Gilbert 发明的化学断裂法 焦磷酸测序 。 前两种方法一般都会用放射性32P对DNA进行标记，需要使用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对长度不同的核酸片段进行分离，分离以后还需要使用放射自显影的技术进行观察和分析。目前已普遍使用荧光物质代替放射性同位素对DNA进行标记。焦磷酸测序是新一代DNA序列分析技术，该项技术无需电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。.末端终止法 末端终止法也叫双脱氧法。要想理解此方法的原理，需要对DNA复制的过程有所了解。DNA是一种双螺旋分
14、子，其复制是在DNA聚合酶催化下，以原来的两条母链上的核苷酸序列为模板，通过互补配对的方式合成新DNA链的过程。复制需要引物和四种dNTPs，总是从5-端向3-端进行。细胞内DNA复制的引物一般是RNA，但体外DNA复制的引物可以是人工合成的与模板链互补的一段寡聚脱氧核苷酸。复制开始于引物3-端自由的羟基，依据碱基互补配对的原则，不断地形成新的3,5-磷酸二酯键，使DNA链得到延伸，直到一个新的DNA分子完全被合成。.末端终止法? 进行四组平行反应? 每一组反应混合物含有dATP, dGTP, dCTP和dTTP，有一种被32P标记? 每一组反应含有一种少量的ddATP或ddGTP或ddCTP
15、或ddTTP。? 在多数情况下，聚合酶使用正常的核苷酸，DNA合成正常延伸。? 有时，聚合酶使用ddNTP，而导致末端终止。? 每一组反应中ddNTP的随机插入留下一系列长度不等的以该双脱氧核苷酸结尾的DNA链。? 对每一组反应混合物走凝胶电泳。? 片段越短，走的越快，就越靠近凝胶的底部。? 从凝胶的底部向上读出序列。? 将读出的序列转化成互补链的序列。.化学断裂法 其基本原理是用特殊的化学试剂，处理待测的具有末端放射性同位素（32P）标记的单链DNA或者只有一条链的末端被放射性同位素标记的双链DNA片段，造成特定碱基的修饰、脱落和戊糖-磷酸骨架被特异性切割，从而产生一组长度不同的DNA链降解
16、产物，经聚丙烯凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。.化学断裂法 进行四组平行的反应： G特异性剪切 在碱性条件下，先用硫酸二甲酯（ DMS ）处理，然后再使用哌啶处理。 嘌呤碱基特异性剪切DNA先进行酸处理，然后再加DMS。 嘧啶碱基特异性剪切先用肼处理，然后用哌啶处理。 C特异性剪切在高盐浓度下，先用肼处理，然后用哌啶处理。 即进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影。比较G、AG、CT和C各个泳道，自下而上从自显影片上就可读出DNA序列。.焦磷酸测序 焦磷酸测序需要在同一反应体系中发生由4种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链的3-端并释放出等量的焦磷酸基团（PPi）。PPi可转化为可见光信号，并最终转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。第一轮反应结束后，再加入下一种dNTP，继续下一轮DNA链的合成。.DNA自动分析仪的组成.RNA一级结构的测定 目前用来测定RNA一级结构的方法主要有：（1）先使用逆转录酶将待测RNA逆转录成cDNA，然后再使
