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1、. . v .产青霉素酶杆菌的别离、优化及酶活力的检测一、实验目的1、了解采集土样的要求和方法。2、掌握由土壤中别离产青霉素酶的根本原理和操作技术。3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。4、学习并掌握细菌培养基的制备。5、学习并掌握细菌发酵液产酶活性的检测方法。二、实验原理青霉素酶 (EC3. 5. 2. 6) 是催化水解青霉素 -酰胺环 , 使青霉素变成无抗菌活性的青霉素酮酸的一类 -酰胺酶。早在 1940 年青霉素还未广泛应用于临床时,Abraham 等就从耐青霉素的E.coliK12 中发现了青霉素酶 , 该酶也是关于-酰胺酶的首次报道。随后在地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌中相继发现
2、了这种特性的青霉素酶。并对地衣芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌产青霉素酶的发酵条件、酶学性质和基因序列进展了研究。虽然细菌产生青霉素酶是导致出现耐药性的原因之一, 但利用青霉素酶具有水解 -酰胺类抗生素的特点 , 可将其用于抗生素药品质量检验和新抗菌药物筛选。该酶最具广阔应用前景的用途是用于对牛奶中的青霉素残留量的快速定量测定和对青霉素超标牛乳进展处理。国外在 20 世纪 80 年代中期就开展了青霉素酶固定化及处理青霉素超标牛乳的研究, 近年对青霉素酶生物传感器的研究非常活泼。另外, 由于青霉素酶具有价格低廉和灵敏度高等优点 , 其可在酶联免疫吸附试验(ELISA ) 中替代传统的辣根过氧化物酶和碱性磷
3、酸酶。 我国在青霉素酶的研究方面起步较晚。1999 年,中国药品生物制品检定所在我国最先别离出一株能产生青霉素酶的蜡状芽孢杆菌CM CC (B ) 63301, 并对该酶的发酵方法、水解酶谱和保存稳定性等方面进展了研究。该菌株作为青霉素酶产生菌已被收入中国药典。但目前国在青霉素酶的研究和应用方面的报道较少。. . v .枯草芽孢杆菌芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7 0.8 2 3 微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6 0.9 1.0 1.5 微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落外表粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成
4、皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是 -淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取 5-核苷酸酶的菌种。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。枯草芽孢杆菌的作用机理：1、枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；2、枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低
5、肠道PH 值，间接抑制其它致病菌生长；3、刺冲动物免疫器官的生长发育，激活T、B 淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力； 4、枯草芽孢杆菌菌体自身合成 -淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体的消化酶类一同发挥作用；5、能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B 族维生素，提高动物体干扰素和巨噬细胞。三、实验材料1.溶液和试剂牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、硫酸铁、1mol/L 氢氧化钠、 1mol/L 盐酸、琼脂、枸橼酸钠、 K2HPO4 . . v .2仪器和其他用品试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试
6、纸pH5.59.0 、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、移液枪 20 L、200 L、1000 L 、枪头四、实验步骤及结果注意：所有试验操作均要在无菌条件下进展，防杂菌污染。（1） 操作在无菌室，吴俊祥，超净工作台上进展， 双手用 70-75% 酒精棉球擦拭。（2） 培养容器试管，培养皿等要事先灭菌，培养时加盖。（3） 接种用具要灭菌。试验流程：时间安排：5月 16日：采集土样 XX 山土，沙土，泥土。5月 19日：土样稀释、倒平板、接种。5月 21日：初选菌落，培养24小时。5月 22日：配制含有 10000单位/mL 青霉素的平板 5 个，将 4000单位青霉素的平板上的菌落转接到 10
7、000单位/mL 青霉素的平板上，30 培养 24 小时。5月 23日：配制含有 20000单位/mL 青霉素的平板 4 个，转接，30 培养 24小时。5月 24日：选出生长较好的 12株菌，接种到含有 20000单位/mL 青霉素的液体培养基试管，摇床培养 24小时。5月 25日：观察发现只有一支试管沙3中液体出现浑浊，保存菌种于一支斜面。5 月 28 日：又发现了 3 支试管中液体出现浑浊，并将他们保种于斜面。将沙3的菌种取出 1mL 接到含 1 万单位青霉素的摇瓶 ,1mL 接到含 2 万单位青霉素的摇. . v .瓶中，摇床培养24小时。同时将 3 支浑浊试管中的菌液各取出1mL 接
8、到含 1 万单位青霉素的摇瓶中，摇床培养24小时. 5月 29日：正交试验，紫外诱变5月 30日：酶活力的测定5月 31日：酶活力的测定实验步骤：（一）菌种的别离与纯化牛肉膏蛋白胨培养基【配方】牛肉膏3g 蛋白胨10g 氯化钠5g 琼脂15-20g 水1000ml PH 7.0-7.2 材料及仪器土壤样品，无菌水，无菌玻璃棒，接种环，酒精灯，采土铲，细目筛，药勺，称量纸，试管架，小天平，记号笔，镊子，圆滤纸片，15 150mm试管，无菌漏斗，牛皮纸袋，培养皿， 1ml、5ml吸管， 250ml三角瓶 (带玻璃珠 )，玻璃刮铲，实验具体步骤：称量和溶化按要求称取药品，并加热搅拌使之溶解。调节 p
9、H 先确定溶液此时的PH，再根据情况调节 pH 至 7.0-7.2 分装将配制好的培养基分装入四个200ml 的三角瓶，每瓶约150ml，注意不要使. . v .培养基粘在瓶口上，以免引起污染。加纱布与包扎三角瓶加塞后，外包牛皮纸，用线绳以活结形式扎好，在皮纸上标明名称、组别、日期。灭菌0.1Mpa 1530min高压蒸汽灭菌。将培养皿、玻璃棒、分装器一起灭菌。 冷却待冷却至 60，取出两瓶 150ml的培养基，向其中一瓶参加18.75mg的青霉素，使其青霉素浓度为200u/ml，倾倒斜面平板，待冷却后，将另外的150ml培养基分装于平板上，是平板成平面，并在平板底部做好标记，浓度的梯度趋势。
10、1采样：选取离地面 510 cm处的土，用小铲子取样，将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。准确取样10 克，参加装有 90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，震荡约 20min，使土样与水充分混匀，静置，取上清液。（2） 稀释 用一支无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液参加装有9ml 无菌水的试管中，吹吸 3 次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液 ;以此类推，制成 10-1，10-2， ， ， ， ，10-6等一系列稀释菌液，编号。（3） 将梯度培养基编号。（4） 将无菌平板编上10-3,10-4，每浓度涂布两个平板，共有三个土样，每个每个土样接种两个浓度。 用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-3
11、 10-4 稀释液各 0.1ml放入编号的平板中，再用无菌玻璃棒将菌液在平板上涂抹均匀。三种土样，每个稀释度各涂布两个培养基，共需要12个培养基（5） 培养在 30条件下倒置培养24h。菌落的判断. . v .菌落外表粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭,需氧菌 .在肉汁培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、外表粗糙皱褶，24h后菌落直径为 3mm。配制青霉素浓度分别为1000u/ml 2000u/ml 4000u/ml浓度的培养基各两个。即共制作 6 个培养基，待接种使用。（6） 观察不同培养基上菌落的形态，首先根据芽孢杆菌的菌落特诊初步判断菌落种类，然后用结晶紫染
12、色的方法确定是否为所需杆菌，挑选出生长良好的20株杆菌菌落，分别接种于三个不同浓度的培养基中，每个培养基点接10个菌落，30恒温箱中培养 24h。配制青霉素浓度分别为10000u/ml,20000u/ml 浓度的培养基各两个，即共配制4 个培养基，待接种使用。（7） 观察不同培养基上菌落的生长状况，挑取生长良好的12株菌落，分别接种于培养基上，每个培养基接种6 株，在 30条件下倒置培养24h。配制青霉素浓度为20000u/ml 的 LB 液体培养基，分装于12支试管中。8观察培养基上菌落的生长状况将青霉素浓度为20000u/ml 的培养基上的所有菌落都接种于 LB 液体培养基中， 挑取青霉素
13、浓度为 10000u/ml 培养基上长势良好的菌落也接种于液体培养基中，共挑选了12株，32恒温摇床培养 24h。9通过培养，有一支试管培养基变浑浊，将试管中的菌种斜面保存。另外，量取试管中菌液各 1ml， 分别接种在青霉素浓度为10000u/ml,20000u/ml的两个含 100ml LB液体培养基中， 32恒温摇床培养 24h。(10)两个摇瓶培养基中都十分浑浊，分别取菌液保种。. . v .【附注】结晶紫染色法结晶紫染色液(Crystal Violet Staining Solution) 是一种组织或细胞染色时常用的可以把细胞核染成深紫色染色后的的染色液。用于革兰氏染色.，结晶紫是一
14、种碱性染料，可以和细胞核中的DNA结合，从而产生细胞核染色。简单染色法是一种最根本的染色方法，是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，而碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。所以通常采用碱性染料如美蓝、结晶紫、碱性复红、孔雀绿或蕃红等进展染色，当这类染料解离后，染料离子带正电荷，使菌体着色实验步骤：1、涂片：用消毒棉球擦拭双手，用镊子取干净载玻片一块，在载玻片的左、右两端各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，涂培养基中生长良好的菌落，做成浓菌悬液。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。2、晾干：让
15、涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用文火烘干。3、固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰23 次固定，以不烫手为宜。4、染色：用将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加结晶紫染液1-2min。5、水洗：水洗去涂片上的染色液。6、枯燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干，勿将菌体擦掉。7、镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。（二）菌种的紫外诱变1取青霉素浓度为20000u/ml 的液体培养基中1ml，按十倍稀释法稀释到10-4 ，然后将稀释 1000倍的菌液涂布于5 个 LB 培养基上，分别将5 个培
16、养基在紫外线照射45s 、75s、105s 、135s 、165s ，同样，将稀释 10000倍的菌液涂布 5 个 LB 培养基上，紫. . v .外线诱变同样时间。230恒温培养 24h后，观察菌落生长情况。菌落生长的很小，在培养基靠边缘的地方有很多菌落生长，因为紫外线没有照射到。3 30恒温继续培养 24h 后， 观察得稀释 1000倍诱变 135s 、 稀释 10000倍诱变 75s的生长情况最好。诱变结果将生长在稀释 1000倍诱变 135s 、稀释 10000倍诱变 75s两个培养基上菌落挑取，保存于斜面。（三）菌种产青霉素酶的条件的选择1为了使别离后得到菌种产生更多的青霉素酶，设计正交试验，配制9 个 100ml的液体培养基，每个培养集成分如下：蛋白胨1.5g 甘油5g 牛肉膏0.4-0.5g 硫酸镁0.02g 氯化钠K2HPO4 枸橼酸钠水定容到100ml 表 1.正交表实验设计因素水平氯化钠K2HPO4 枸橼酸钠1 2 3 0.3g 0.4g 0.5g 0.3g 0.4g 0.5g 0.488g 0.588g 0.688g 表 2.正交表实验方案. . v .编号氯化钠
