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1、第十一章蛋白质的相互作用(Protein-Protein Interactions)1. 概况随着人类基因组测序工作的完成，生命科学进入到后基因组和蛋白组的时代。因此， 蛋白质的相互作用研究就显得越来越重要。生命活动过程与蛋白质的相互作用是密不可分的，如DNA 合成、基因转录激活、蛋白质翻译、 细胞周期调控、 信号转导等重要的生命过程均涉及到蛋白质复合体的作用。下面以 Wnt 信号通路为例对此加以说明。Wnt信号通路是一条保守性很强的信号通路，该通路调节控制许多的生命过程，如细胞形态与功能的分化及维持、免疫、应激、细胞癌变与凋亡等等。 Wnt 信号通路的作用分子包括： Wnt 蛋白家族成员、卷
2、曲 (frizzled) 蛋白、 Dishevelled 蛋白、 -联蛋白 ( -catenin) 、轴蛋白 (axin) 、结肠癌抑制因子 (APC) 、糖原合酶激酶 (GSK3 )、-TrCP 蛋白、淋巴增强因子 (LEF)/T 细胞因子 (TCF) 等。当没有 Wnt 信号时， GSK3、 APC 、axin 组成破坏复合体，使 -联蛋白被磷酸化，最终泛肽化而降解。细胞核内，转录抑制因子 Groucho 家族成员与转录因子 TCF 形成复合物， 通过 HMG 框结合在靶基因上， 抑制靶基因的转录。当有 Wnt 信号传入时，通路中的下游分子Dsh 抑制了破坏复合体的作用，-联蛋白在胞质中积
3、累进入核内， TCF 与入核的-联蛋白结合，导致其与Groucho 的结合下降，从而去除抑制作用，激活了靶基因的 转录。从上面可以看出，蛋白质的相互作用包括三个方面： 多亚基蛋白质的形成：即别离纯化后可形成两个或多个不同蛋白质，如血红素、色氨酸合成酶、大肠杆菌 DNA 合成复合酶等。 多成分的蛋白质相互作用，如核孔复合体、剪接体、纺锤体等。 瞬时的蛋白质相互作用，控制着一些重要的生命活动。所有的蛋白质修饰过程都需要这类相互作用。这类相互作用几乎参与调节细胞内根本生命活动的所有形式，如细胞生长、细胞周期、代谢途径、信号转导等。除了蛋白质修饰以外，其他过程如转录复合体与特定启动子的结合、蛋白质的跨
4、膜运输、新生肽链的折叠、也包含了瞬时的蛋白质相互作用。2. 蛋白质相互作用的研究策略与方法生化方法蛋白质亲和层析 方 法在一定的条件下，某种蛋白质可以共价连接在基质如琼脂糖(Sepharose) 上，用以结合抽提物中能与该种蛋白质结合的配体蛋白质，抽提物过柱后， 用低盐溶液洗脱下未结合的物质，然后用高盐溶液或SDS 洗脱下结合在柱上的蛋白质。有时污染物的存在会影响相互作用的结果，因此蛋白质纯化是蛋白质亲和层析成功的前提。 蛋白质的纯化方法获得纯化蛋白质的一个简单方法就是利用融合蛋白，目前常用的融合蛋白为谷胱甘肽S 转移酶(glutathione S-transferase, GST) ，可以在
5、谷胱甘肽-琼脂糖柱上纯化。其他的还有staphylococcus 蛋 白 A 可在含 IgG 的柱上纯化；含少数组氨酸的肽段在镍柱上纯化；麦芽糖结合蛋白可以在含直链淀粉的柱子上纯化。 检测方式蛋白质亲和层析在亲和柱上，可以利用纯化的融合蛋白以两种方式检测相互作用。一是将融合蛋白共价链接在树脂上，让抽提物过柱；二是把融合蛋白共价结合在珠子上，使抽提物和珠子混在一起。 优 点利用蛋白质亲和层析来检测蛋白质的相互作用有以下四个方面的优点： 灵敏度高： 在高浓度固定蛋白质的条件下，可以检测微弱的相互作用结合常数为10-5 mol/L),而生理上相关的最微弱的相互作用在10-3mol/L 范围内。 可以
6、同时检测抽提物中所有的蛋白质，即所有蛋白质与固定蛋白质的结合时机均等。 通过构建突变体，可以检测与特异性相互作用有关的蛋白质结构域或关键的氨基酸残基。 可以检测多亚基蛋白质之间的相互作用。 出现假阳性结果的原因及局部消除方法虽然蛋白质亲和层析技术能有效地检测蛋白质相互作用，但是也存在一些假阳性的结果，原因有以下几点： 电荷间的相互作用是带电性质相反的两种蛋白质相结合；可以用带相同离子电荷的对照柱来消除。 通过 B 蛋白， A 蛋白与亲和柱上检测蛋白质间接结合。 两种蛋白质的细胞定位不同，但是人为因素提供结合时机，有的甚至能高特异性结合。一个最著名的例子就是肌动蛋白与DNase之间的高亲和力。亲
7、和印迹蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳别离后，转移到NC 膜上，然后用特异性的蛋白质、肽段或配体来检测膜上的蛋白质。该技术与Western blotting 有些类似，只不过Western blotting 是利用抗体的探针。复杂的蛋白质混合物，如全细胞裂解液，通过该技术可以直接分析，而不需要纯化，因此，该方法特别适合于分析膜蛋白，如细胞外表受体。在凝胶电泳之前，可以先别离细胞裂解物以提高该方法的灵敏度，使低丰度蛋白质的相互作用也可以被检测到。该方法涉及几个关键： 膜上蛋白质的生物活性蛋白质配体的制备检测方法通常混合物在有SDS 存在的情况下别离，而在印迹时需要去除变性剂，使变性蛋白质的全部或局部变
8、性。如果蛋白质在变性后无法复性，那就需要一个非变性的胶别离系统。蛋白质探针的制备有多种方 法，探针可以用放射性标记，也可以用生物素标记，或是使用亲和标签等方法。免疫共沉淀 概念：免疫共沉淀是一种经典的检测蛋白质相互作用的方法，其实验过程比较简单。裂解细胞后，参加抗体，抗原被沉淀下来后洗涤，去除非特异性结合，再分析结合复合体。抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。被分析的蛋白质可以加上一个抗原决定簇的标签，如12CA5 、c-Myc ，便于用特异性的抗体检测。 免疫共沉淀实验的真实性需要用以下几条标准来验证 抗原的沉淀是由于本身抗体的结合引起的，而不是制备中被污染的抗体。单克隆抗体不存在这个
9、问题；在使用多克隆抗体时，需要对该抗体进行预处理，即将抗体与不包含抗原的抽提物混合在一起，去除与抗体结合的污染物。 只有在抗原存在的情况下，参加抗体后，才能检测到沉淀蛋白质，即抗体本身不识别沉淀蛋白质。 这种相互作用是否直接或是通过第三个蛋白质引起的。 相互作用是真实的体内过程，而不是细胞裂解的结果。 免疫共沉淀的优点 与蛋白质亲和层析一样，它检测的是细胞裂解原液中所有蛋白质与检测蛋白质的相互作用； 抗原和抗体的相互作用是在生理浓度的条件下被检测的，因此过量表达所带来的假阳性结果可以被排除； 可以检测到在体内形成的天然复合体，如果该复合体无法在体外条件下形成； 天然状态的蛋白质如果经过翻译后修
10、饰，依赖于或不依赖于修饰的蛋白质，相互作用可以被检测到。 免疫共沉淀的缺点虽然该方法应用广泛，但也存在一些明显的缺点。 有时免疫共沉淀的蛋白质并非直接相互作用。如 EIA 与 p107 可以相互作用，p107 与 cyclinA可以相互作用，EIA 与 cyclinA能同时被免疫沉淀。 与其他方法相比如蛋白质亲和层析，免疫共沉淀的灵敏度不高，这是由于抗原浓度低于亲和层析中的蛋白质浓度造成的。化学交联法 (Chemical Crosslinking Approach) 方 法使用一种交联剂，并且在交联试剂的光激活局部带有标记，将该试剂耦联到一蛋白质上，耦联体与抽提物温育在一起。如果抽提物中的A
11、蛋白能与耦联蛋白质发生相互作用，光激活后交联剂的一局部就结合到 A 蛋白上。参加复原剂、切割交联试剂，使A 蛋白上带有交联剂上有标记的局部，然后通过凝胶电泳等方法分析该蛋白质。图 优 点利用交联技术检测蛋白质相互作用的优点有： 它能检测到微弱的相互作用； 它能检测到动态过程不同阶段与不同蛋白质的瞬时相互作用，如糖基化过程； 通过能穿膜的交联试剂，交联可在体内发生。 缺 点主要缺陷是没有选择性，交联试剂可与近范围内的蛋白质发生反响。所以，有时所检测到的蛋白质相互作用可能是个假象，需要通过其他方法加以验证。荧光共振能量转移法(fluorescence resonance energy transf
12、er, FRET) 方 法FRET 是一个无辐射、量子级能量转移现象，它指的是当一个荧光分子即供体受到激发时，能量向邻近的另一荧光基团即受体转移的过程。但仅当受体与供体间的距离小于10 nm 且受体的吸收光谱和激发光谱有重叠时，FRET 才能发生，并且随着光谱重叠的增加，FRET 的效率将增高，同时FRET可能发生的距离也将增加。使用 FRET 可用来检测蛋白质之间的相互作用，将两个蛋白质分别使用 CFP/YFP 或 BFP/GFP) 标记，当两者在同一细胞中表达时，只要检测到 FRET 发生，那么证明两个蛋白质间的距离小于 10nm，存在相互作用。用此方法已经成功地验证了 CFP-钙调蛋白与
13、 M 13-YFP 融合蛋白间、 FHL3 与 FHL2 、EGF 受体与 Grb2 等蛋白质之间的相互作用。 优、缺点GFP-FRET 将活体高分辨率观测和细胞、亚细胞定位相结合，使得用显微镜观察纳米水平的距离变化成为可能，为人们在活体中观察生物大分子的相互作用提供了一个有效方法。但是，在活体 GFP-FRET 的研究中，常常存在着信号太弱、细胞自发荧光等不利因素影响实验结果。生物传感器技术即 BIA (biomolecular interaction analysis)-core ，生物传感器的工作原理是基于外表等离子共振 (surface plasmon resonance, SPR)，
14、即配体和分子结合时会引起作用平面平面或近似平面折射率的变化。这种光信号可被光感受器接受并转换成电信号传递到计算机，再由计算机复原为模拟的生物信号。BIA-core以共振单位 (resonance unit, RU) 来衡量， 1,000 RU 相当于每平方毫米 1 纳克的质量。采用生物传感器检测芯片上的配体与待检分子的结合时，需要考虑很多因素的影响，如原料输送速率、配体种植密度、待检分子浓度、以及这种结合本身的亲和力大小等。原料输送速率是指分子从输送流层投递到芯片外表的速率。这些参数可直接或间接地被实时测量，由计算机推算出初始结合速率。BIA-core除具有现代生物传感器的根本特点外，最大的特
15、色在于其附带的分析软件。它内置假设干 描述蛋白质相互作用的方程模型，在模型的根底上根据采集的数据给出结合速率对各参数的偏微分方程， 计算出初始结合率。采用人机对话框，可根据要求作图和给出数据。同时生物传感器也可与质谱联用，直接监测芯片上配体所捕获的分析物分子的相对分子质量。2.2 分子生物学方法酵母双杂交酵母双杂交系统于1989 年由 Fields 和 Song 创立，是用来研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的简便而有效的方法，又称为“相互作用陷阱。双杂交系统通常在酵母细胞中构建，首先需要构建两种杂合反式作用因子，将蛋白质X 与报道基因转录因子的特异BD (DNA binding Domain, DNA结合结构域， 如 Gal4-BD, LexA-BD)融合， 成为 “诱饵蛋白。蛋白质 Y 与特异的AD (activation domain ，转录激活结构域， 如 Gal4-AD, Lex
