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1、第13章 体外受精与核移植动物本节主要内容13-1 体外受精动物（试管动物、试管婴儿）13-2 核移植动物（克隆动物）13-1 体外受精动物例如：“世界山羊之王”波尔山羊体格高大，四肢粗壮，身体丰满。平均日增重350克，屠宰出肉率可达60%以上。具有适应性强、采食性广、繁殖性能好、肉用性十分显著等特点。二 优点（1）发挥优良母畜的繁殖潜力：一头优良品种母牛的卵巢内有几万个生殖细胞，但在一个正常性周期内只有几个卵泡同时发育，最后一个卵泡成熟并排卵。一只良种母畜一生大约只能繁殖10个左右的后代，大部分时间用于妊娠和哺乳。试管动物繁殖技术能够充分利用母体生殖潜力。（2）促进家畜改良的速度：繁殖能力的
2、提高促进家畜改良速度，加速育种过程。（3）保存遗传资源：对优良或稀有哺乳动物建立“胚胎库”，进行受精卵或胚胎的长期保存。三 试管动物培育流程（1）精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养（2）体外受精（3）重组胚激活与体外培养（4）胚胎移植(Embryo transfer，ET)：是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的“受体”母畜输卵管或子宫的技术（5）体内发育、出生1 精子采集与体外获能采集：精子上游法采集，在精液上面加入少量培养液，有活力的精子游到表面，收集。精子获能(Capacitation)是指精子获得穿透卵子透明带能力的过程。精子的顶体反应：遇到卵子时
3、，精子头部“顶体”脱落，顶体酶释放，使卵子的放射冠和透明带溶解，精子进入卵细胞，达到受精的目的。体内获能雄性精液中含有“去能因子”（多是：糖蛋白），附在精子表面，是顶体酶的抑制剂，抑制了精子的受精能力。去能因子的清除，使精子顶体酶活性恢复，具有受精能力：主要依靠宫颈、子宫及输卵管液中的淀粉酶、胰蛋白酶、葡糖苷酶及唾液酸酶，后者在卵泡液中含量也很高，可以水解糖蛋白等“去能因子”。体外获能精子由最初在同种或异种雌性生殖道孵育获能，发展到用子宫液、卵泡液、子宫内膜提取液或血清等在体外培养获能，最后用化学成分明确的溶液培养获能。牛、羊的精子常用化学药物诱导获能，诱导获能的药物常用肝素和钙离子载体。19
4、86年Parrish等用含肝素的介质处理牛的冷冻精液，然后与体外成熟的卵母细胞体外受精获得成功。2 卵子的回收与成熟培养(1)超数排卵：雌性动物用孕酮、促卵泡激素和促黄体素处理后，从输卵管中冲取成熟卵子，可直接与获能精子受精。(2)从活体卵巢中采集卵母细胞：借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。成熟卵子的收集卵母细胞体外成熟培养未成熟卵母细胞（初级卵母细胞、次级卵母细胞要经过成熟培养使卵细胞成熟。家畜卵母细胞成熟培养液普遍采用TCM199培养基添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。血清是大分子营养物质的主要来源，而且可提供细胞生长因子。作为能量来源的物质主
5、要是葡萄糖，氨基酸也可作为能源起作用。卵母细胞的体外培养还需对温度、渗透压、pH、气相等进行控制。卵母细胞体外培养：通常采用微滴培养法，微滴体积一般为50-200微升，每个微滴中一般放入10-40个卵母细胞。二氧化碳培养箱培养，条件为39、100%湿度、5%二氧化碳。成熟选择标志：极体排出、透明带软化、卵丘细胞层扩散靠近卵母细胞周围的卵丘细胞呈放射状排列，出现放射冠，用DNA特意性染料染色后，在显微镜下进行核相观察，可见卵母细胞处于第2次成熟分裂中期。3 试管动物的体外受精精子发生顶体反应时，精子顶体外膜与其相贴的卵细胞膜发生多点融合而破裂，继而出现小孔。顶体酶就是通过这些小孔释放出去，使卵细
6、胞周围的卵丘细胞分散并去除放射冠，分解透明带。精子顶体内膜与卵细胞膜相互融合，最终雄性原核和雌性原核合二为一，完成受精过程。一般将成熟的卵母细胞和获能的精子在一个合适的体外环境条件下共同培养一段时间，就能完成体外受精。受精过程所采用的培养液与动物细胞培养用培养液类似，但需添加一些特殊物质，如肾上腺素、亚牛黄酸、肝素等，它们有助于精子穿卵和促使原核的形成。精子和卵子常在小滴中共培养，受精时精子密度为1-9106/ml，每10微升精液中放人1-2枚卵子，小滴体积一般为50-200微升。受精成功观察：将含有受精卵的培养皿放置于倒置显微镜下，卵细胞内出现两个雌雄原核，标志着受精成功。（1）共同培养法（
7、2）显微受精技术是通过人为方法使精子和卵子完成受精过程，由于一般都需要借助显微操作仪来完成，所以又称显微授精为辅助受精技术 (microinsemination)。透明带下注射法术： 用微注射器将3-5个精子直接注射入透明带下的卵间隙，从而使卵子受精。优点是对卵细胞的损伤小，已在临床医学上得到运用，但也存在多精受精问题。卵桨内精子注射法：用微注射器将单个精子直接注射入到卵细胞的细胞质内使卵子受精。这样可以避免多精受精问题。但是精子质量是重要问题。精、卵结合后，透明带的结构发生变化，阻止了其它精子穿越透明带，保证了正常的单精受精。透明带修饰法：运用物理或化学方法对卵母细胞的透明带进行打孔、部分切
8、除或撕开缺口，为精子进入卵黄周隙打开通道，然后把卵子与一定浓度的精子共培养以完成受精过程。这种方法适用于具有一定运动能力，但顶体反应不全，无法穿过透明带的精子。优点是对卵子的损伤小，但对于靠透明带反应阻止多精入卵的动物易造成多精子受精，影响胚胎继续发育。4 胚 胎 培 养受精卵需在体外培养发育至桑椹期或囊胚期（细胞全能性最高）才能进行移植。目前人们还不能在体外模拟子宫内的环境供胚胎继续发育。通常情况，移植的较佳时期是发育至8-16细胞期的胚胎。培养液中成分除无机和有机盐外，还添加维生素、氨基酸、核苷酸和嘌呤等营养成分和血清，最常用的有TCM199、B2和F10。桑椹胚发育阻滞问题体外受精的早期
9、胚胎在体外发育中，往往会停止在某一阶段不再发育，这种现象称为发育阻滞(Developmental block)。发育阻滞是胚胎体外培养的一个主要障碍。造成胚胎发育阻滞的因素比较复杂，与胚胎的母源基因调控向自身基因调控的转换有关，也有培养环境的客观因素。总之，体外培养条件与体内发育条件的差异，造成了胚胎发育被阻断。克服方法：改进培养液成分和建立体细胞共同培养体系5 胚胎移植将胚胎移植到另外一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜（称为“受体”）的相应部位（输卵管或子宫角）。这个来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继续生长和发育，最后产下供体的后代。这就是通常所说的“借腹怀胎”。手术法:将同期化
10、处理后的受体动物仰面固定在手术床上，全身麻醉，腹部切口，将一侧卵巢上有黄体发育的子宫远端拉出，将吸有胚胎的胚胎移植管（图13-1）插入穿刺孔，小心将胚胎输入。这种方法移卵容易、损伤小、成功率较高。羊等小家畜非手术法:使用类似于人工授精的专用输胚枪，将其直接插入排卵侧子宫角内，注入胚胎。牛马大家畜非手术法手术法（6）体内发育、出生胚胎移植后处理与观察：胚胎移植后需补充黄体酮，目前多采用注射法给予黄体酮。胚胎移植后14天，可由验尿或抽血确定是否妊娠。如果确定妊娠，则改用hCG人绒毛膜促性腺激素继续补充到怀孕10周。妊娠后14天，B超检查胎儿数及胚胎着床部位。免疫胶体金法 13-3 试管婴儿试管婴儿
11、（Test-tube babyy）是指将卵子与精子取出在体外受精，培养发育成早期胚胎，再植回母体子宫内发育出生的婴儿, 也就是采用体外受精联合胚胎移植技术培育的婴儿。试管婴儿的培育流程良好男性供体人工取精女性供体的超排卵人工受精受精卵采集 胚胎体外培养女性受体选择与胚胎移植体内发育与后代降生莱斯莉 布朗和约翰布朗是英国一对不孕夫妇。1977年夫妇向试管受精技术先驱罗伯特 爱德华博士及帕特里克 斯特普托博士求助。1978年 7月 25日，世界首例试管婴儿路易斯 布朗在英国诞生 。成为当年全球媒体竞相报道的头条新闻6年后，布朗夫妇二度借助试 管 受精技术，再添一女。现在 Louis Brown路易
12、斯在邮政部门工作，2004年 9月 4日，路易斯与时年34岁的安保部门官员韦斯利姆林德喜结连理。1988年3月10日 我国第一个试管婴儿诞生来自全国各地的试管婴儿欢聚一堂，为郑萌珠庆贺生日1987年5月，甘肃礼县盐关镇的郑桂珍老师来到北京城，希望做母亲的愿望得以实现。截止2006年世界诞生300万试管婴儿。著名的产科专家北京三院张丽珠教授怀抱刚出生的试管婴儿郑萌珠2000年，我国首例超快速冷冻胚胎移植的试管婴儿在湖南医科大学诞生。华兹（Ed第一代试管婴儿：主要特征是模拟体内受精过程，将精子与卵子通过共培养完成受精。1977年，爱德（Edwards）和斯蒂普特(S特(Steptoe)创造的试管婴
13、儿为第一代试管婴儿。第二代试管婴儿：是指采用显微注射仪将单个精子注射进卵细胞内受精培育的婴儿。由于使用的是非自然选择的精子进行受精，因此可能将遗传缺陷传给下一代，同时显微授精操作容易造成卵细胞损伤。第三代试管婴儿：经过种植前胚胎遗传学基因诊断培育出的试管婴儿被称为第三代试管婴儿。取出部分细胞进行基因诊断，排除带致病基因的胚胎。第四代试管婴儿 借助别人卵浆增强自己卵子活力 特征：卵浆置换 主要针对那些卵子质量不高、活力差的高龄女性超数排卵在月经周期第3-9d时，利用促性腺激hMG或CC药物素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵（superovulation）
14、意义：让每个供体提供更多的胚胎视频学习网站体外受精http:/ 核移植动物一 定义细胞核移植（Cell nuclear transfer）是利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的技术。细胞核移植动物：是用特定发育阶段的核供体及相应的核受体（去核的卵子）体外构建重组胚，通过胚胎移植达到受体，发育出生的动物。理论基础：动物细胞核具有发育成个体的全能性，因此克隆动物可以通过细胞核移植实现。但是，细胞核移植所得到的动物为核质杂种。克隆动物一般指采用核移植、胚胎移植技术得到的动物。二 核移植动物培育技术流程1-核供体细胞的获得与取核2-受体细胞的去核3-细胞核移植4-重
15、组胚的激活、培养和移植5-核移植后代的鉴定1 核供体细胞获得与取核供核细胞可以是动物原代细胞或传代细胞。分离制备单个动物细胞，体外培养得到正常二倍体体细胞系，然后进行15 天的缺血饥饿培养，诱使细胞处于“静止”状态（一般进入G0 期）。采用细胞松弛素B（Cytochalasin B）诱发细胞排核或者显微操作取核等方法得到细胞核。2 受体细胞去核（1）盲吸去核法：用微细玻璃管吸除处于MII分裂中期的卵细胞染色体及周围的部分细胞质。 用荧光染料Hoechst33342对卵细胞DNA进行染色，在紫外观察下去核可提高去核成功率。（2）功能性去核法：使用Hoechst33342与卵细胞DNA结合后，用紫
16、外线或激光定点照射使核功能丧失。（3）化学诱导去核法：使用脱羰秋水仙素处理卵细胞，迫使核染色质全部进入第二极体细胞。3 细胞核移植细胞核移植可以采用胞质内注射和透明带下注射方法。前者是用微吸管吸取供体核后，直接注射进卵子细胞质。后者是把细胞核注射进透明带和卵细胞间的卵周隙中。核移植方法将受体卵细胞 去核 移植后的细胞激活后可以象受精卵一样发育形成动物个体，并具有与核供体细胞相同的基因向去核卵细胞植入供体细胞 核核移植与动物克隆4 重组胚激活正常受精卵的发育启动和早期卵裂主要由卵母细胞胞质中母源信息所控制，成熟的卵母细胞质能使移入的细胞核在形态上和功能上发生变化，从而导致供核回复到初始状态，基因从头开始顺序表达。而核移植重组胚的发育需要进一步激活，可以采用电激活和化学激活方法。（1）电激活：是可把重组胚放在电融合槽两极之间，用几次瞬时直流脉冲刺激使其激活。（2）化学激活：常用的激活剂包括7%乙醇、SrCl2、放线菌酮、离子霉素等。锶5 重组胚培养和移植激活后的重组胚可以采用体内和体外两种培养方式。（1）体内培养：是将重组胚移植入同种或异种受体动物的输卵管发育至桑葚胚或囊胚期(8-16 c
