《第二章发酵液的预处理和固教学教材》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第二章发酵液的预处理和固教学教材（62页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式*1第二章 发酵液的预处理和固液分离第一节 发酵液的预处理预处理的目的：分离菌体和其他悬浮颗粒，除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，利于提取精制后续工序的顺利进行；菌种不同、发酵液特性不同，预处理方法选择也不同。 胞外产物：经预处理使目的产物移至液相，经固液分离，除去固相； 胞内产物：收集菌体或细胞，进行破碎，使目的产物移至液相，进行细胞碎片分离。发酵液的预处理微生物发酵液的成分： 微生物菌体、残存的培养基、未利用完的糖类、无机盐、蛋白质、微生物的各种代谢产物等。 发酵液过滤特性的改变 目的：通过对发酵液进行适当的预处理，即可改善其流体性能，降低
2、滤饼阻力，提高过滤与分离的速率。 方法：调酸(等电点)、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻解冻及添加助滤剂等。 滤饼的过滤速率一、微生物发酵液的特性微生物发酵液的特性： 发酵产物浓度较低（110%），悬浮液中大部分为水； 发酵液是组分非常复杂的混合物； 悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大； 固体粒子的可压缩性大； 液相粘度大（多为非牛顿型流体）； 性质不稳定，随时间发生变化。二、发酵液的预处理（改善发酵液过滤特性的物化方法）降低液体粘度：滤液通过滤饼的速率与液体粘度成反比。 加水稀释法： ， 过滤，会增加悬浮液的体积，加大后续处理任务。 加热法：提高温度，有效
3、 ， 过滤；蛋白质凝聚成较大颗粒凝聚物。一般加热温度控制在6580C。 适用于对非热敏感性产品发酵液预处理； 使用时严格控制加热温度和时间。二、发酵液的预处理（续）调整pH（预处理中较常用方法）： pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，调节pH可改善其过滤特性； 如调液pH值使蛋白质等达到等电点以除去；膜过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，调pH值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染。 调pH时，选较温和的酸或碱，防止局部过酸、过碱。常用草酸二、发酵液的预处理（续）凝聚与絮凝(最常用的预处理方法): 能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质、蛋白质等胶体粒子的分散状态
4、，使其聚集成较大颗粒，利于固液分离，还能有效除去杂蛋白和固体杂质。 常用于菌体细小，粘度大发酵液的预处理。 凝 聚凝聚：在电解质（中性盐）作用下，胶粒间双电层电排斥作用降低，电位下降，使胶体体系不稳定的现象。凝聚作用就是向胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质中异电离子作用下，胶粒的双电层电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集的现象。凝聚技术阳离子对带负电荷的发酵液胶粒凝聚能力的次序为：Al3+Fe3+ H+ Ca2+ Mg2+ K+ Na+ Li+常用的凝聚剂（电解质）为：Al2(SO4)318H2O (明矾)、AlCl3 6H2O、FeCl3、ZnSO4等。采用凝聚的方法
5、得到的凝聚体颗粒比较小。絮 凝絮凝：在高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使细胞、胶粒等聚集成粗大的絮凝团。絮凝剂：一种能溶于水的高分子聚合物，相对分子质量大，具长链结构（链节含许多活性官能团）。作用力：由静电引力、范德华力或氢键作用力等吸附于胶粒的表面。絮凝剂絮凝剂化学结构： 分子含相当多的活性官能团，使之能与胶粒表面相结合； 必须具有长链的线性结构以便同时与多个胶粒吸附形成较大的絮团。 相对分子质量不能超过一定限度，以使其具有良好的溶解性。絮凝剂的分类按其活性基团在水中的解离情况分为三类：非离子型、阳离子型和阴离子型按来源不同，工业使用的絮凝剂又分为： 有机高分子聚合物（聚丙烯酰胺类衍生物和
6、聚苯乙烯类衍生物、聚丙烯酸类阴离子）； 无机高分子聚合物（聚合铝盐、铁盐等）； 天然有机高分子絮凝剂（聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、壳多糖等） 微生物絮凝剂（含糖蛋白、黏多糖、纤维素、核酸等高分子）影响絮凝效果的因素絮凝效果与发酵液的性状（细胞浓度、表面电荷种类和大小）有关，不同发酵液应选不同絮凝剂；对一定发酵液，与絮凝剂的加量、分子量和类型、溶液pH、搅拌速度和时间有关；在絮凝过程中，常需加入一定的助凝剂以增加絮凝效果。絮凝技术优点：提高固液分离速度，分离菌体、细胞和细胞碎片等；有效去除杂蛋白质和固体杂质，提高滤液质量。亲和絮凝：细胞絮凝技术发展的新动向，利用絮凝剂和细胞膜表面某种组分间具有
7、的专一性亲和连接作用而产生吸附架桥作用。带负电荷的菌体 或蛋白质阳离子型高分子絮凝剂 非离子型和阴离子型高分子絮凝剂电解质 非离子型和阴离子型高分子絮凝剂+?包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。先加凝聚剂，再加絮凝剂。二、发酵液的预处理（续）加入助滤剂： 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，可使滤饼疏松，提高过滤速度。 常用助滤剂：硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩等。 加入方法：过滤介质表面预涂助滤剂；直接加入发酵液中；或两种方法兼用。选择和使用助滤剂要点根据目的产物选择助滤剂品种；根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂品种； 粒度选择： 与悬浮液中固体粒子的尺寸相适应。使用量选择： 与悬浮液中固形物含量
8、相等，过滤速度最快。二、发酵液的预处理（续）加入反应剂： 加入某些反应剂（不影响产物），利用反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀。作用：生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，从而改善过滤性能。单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式*22三、发酵液的相对纯化高价无机离子的存在： 影响树脂对生化物质的交换容量。可溶性蛋白质的存在： 降低离子交换和吸附法提取时交换容量和吸附能力；在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清；在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影
9、响过滤速率。1、高价无机离子的去除方法发酵液中的主要无机离子：Ca2+、Mg2+、Fe2+等。 去除钙离子，宜加入草酸； 去除镁离子，可加入三聚磷酸钠； 去除铁离子，可加入黄血盐，形成普鲁士蓝沉淀。2、杂蛋白质的去除方法沉淀法: 蛋白质在酸性溶液中，能与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子如Ag+、 Cu2+ 、Zn 2+、Fe 3+ 和Pb2+等形成沉淀。吸附作用: 加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。 例如：在枯草芽孢杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并
10、包裹在其中而除去，从而可加快过滤速率。2、杂蛋白质的去除方法变性法：加热，大幅度调节pH，加酒精等有机溶剂或表面活性剂等。 例如：抗生素生产中，常将发酵液pH调至偏酸性范围(pH2-3) 或较碱性范围(pH8-9)使蛋白质凝固，一般以酸性下除去的蛋白质较多。变性法的局限性：加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH也会导致某些目的产物失活，并且要消耗大量酸碱；而有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。第二节 发酵液的固液分离固液分离的目的： 收集胞内产物的细菌或菌体，分离除去液相； 收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物；固液分离的方法：离心分离、过滤、分离筛、重力沉降、浮选分离
11、。 不同性状的发酵液应选择不同的固液分离方法霉菌和放线菌发酵液：过滤方法细菌和酵母菌发酵液（未经预处理）：高速离心。细菌和酵母菌发酵液（进行预处理）：过滤方法。 举例：如菌体较小的氨基酸发酵液，采用絮凝和添加助滤剂等方法进行预处理后，即可用板框过滤机或带式过滤机进行菌体分离 一、影响固液分离的因素发酵液中细胞或菌体、各种悬浮粒子的大小和形状： 粒子越小，分离难度越大，费用越高。发酵液或细胞培养液的黏度： 黏度与固液分离速度成反比，黏度越大，固液分离越难；发酵液的pH；发酵液的温度；发酵液的加热时间。二、过滤发酵液的过滤特性： 发酵液属非牛顿型液体，滤渣为可压缩性的。1、影响过滤速度的因素过滤速
12、度与菌种、发酵条件有关： 菌种对过滤速度影响很大： 真菌：菌丝较粗大，易过滤； 放线菌：菌丝细而分枝，交织成网状，较难过滤，需预处理； 细菌：菌体细小，过滤十分困难，要预处理。 培养基组成： 发酵终了时间的确定。2、过滤设备板框压滤机： 传统设备，广泛应用 结构简单、装配紧凑、过滤面积大，适应性强，过滤推动力能大幅调整等。 设备笨重，间歇操作、辅助时间多，效率低； 自动板框过滤机2、过滤设备鼓式真空过滤机： 大规模工业生产； 连续操作，实现自动控制，处理量大，适于固含量10%的悬液（霉菌发酵液）； 不适于菌体较小和黏度较大的细菌发酵液过滤（受推动力真空度限制）。 其过滤所得固相干度不如加压过滤
13、。3、过滤设备硅藻土过滤机： 硅藻土是优良的过滤介质，也是优良的助滤剂； 硅藻土用法： 作为深层过滤介质； 支持介质表面预涂硅藻土薄层； 分散在待过滤的悬液中。三、离心分离离心机： 利用转鼓高速转动所产生的离心力，实现分离。可分离悬浮液中极小的固体微粒和大分子物质。优点：分离速度快，效率高，液相澄清度好等。缺点：设备投资高，能耗大。1、离心机：按作用原理分类过滤式离心机： 转鼓上开小孔，有过滤介质，离心力下，液体穿过过滤介质经小孔流出而得以分离。 用于处理悬浮液固体颗粒较大、固含量较高的物料。沉降式离心机： 转鼓上无孔，离心力下，物料按密度大小不同分层沉降分离。 用于液-固、液-液、液-液-固
14、分离。2、常见离心分离设备碟片式离心机： 是沉降式离心的一种，应用较广泛； 适应于细菌、酵母菌、放线菌等悬浮液及细胞碎片分离。管式离心机： 沉降式离心机，分离效率很高； 生产能力小，适宜一般离心机难以分离，固含量1%的发酵液的分离。 可用于细胞、细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等生物大分子的分离。2、常见离心分离设备倾析式离心机： 螺旋卸料沉降离心机； 靠离心力和螺旋推进作用自动连续排渣； 可连续操作，适应性强，应用范围广，结构紧凑，适于固含量高的悬浮液分离； 不适于细菌、酵母菌等分离；常用于淀粉精制、废液处理等。常用离心机的特性及选用管式碟片式螺旋倾析式间歇排渣连续固体含量（%）0.01
15、-0.20.1-51-105-50微粒直径（10-6m）0.01-10.5-150.5-152排渣方式间歇或连续间歇连续连续滤渣状况团块装（间歇）糊膏状糊膏状较干分离因素（g）104-6 105103-2 104103-2 104103- 104最大处理量（m3/h)102003002003、其他固液分离方法切向流过滤（又称错流、交叉、十字流过滤）： 维持恒压下高速过滤的技术。 悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切力作用将介质表面的固体（滤饼）移走，提高过滤速度。 在膜过滤中广泛使用。3、其他固液分离方法双水相萃取： 分离大分子物质； 分离细胞碎片、胞内蛋白质第三节 全发酵液提取避开
16、固液分离操作，从悬浮液中直接提取生化物质。 直接吸附有可能回收液相中的全部产物； 直接吸附缩短了加工时间，减少产物受污染和降解的机会，有可能提高产量； 直接吸附可同时除去大量的液相杂质，使产物很快得到纯化。全发酵液提取研究趋向用膜技术进行全发酵液的提取； 关键是连接的配基容量要大；要解决膜孔道污染问题用双水相萃取进行全发酵液的提取； 要选择合适的双水相系统和操作条件用扩张床吸附进行全发酵液提取。扩张床吸附(expanded bed adsorption)一种将固体颗粒去除和目标蛋白纯化合并在一步完成的新型技术。经一步操作即可同时完成料液的澄清、浓缩和初步纯化，减少操作步骤，缩短时间，降低成本，提高收率。可应用于各种发酵液和培养液中初步提纯生物大分子产物。其吸附机理涉及各种分离技术（离子交换、亲和及疏水作用。扩张床吸附是固定床和流化床优点的综合扩张床吸附扩张床，料液自下而上，床层中球形介质处于松散状态，由于颗粒大小不同而稳定分级在床层的某一位置，料液中的固体可以穿过床层中颗粒之间的松散空隙而透过床层，省去固液分离步骤。传统的固定床，料液自上而下，床层颗粒紧密堆积，料液必须先除去固体，以免
