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1、第三节DNA重组技术第一个 DNA 重组子 （Paul Berg, 1972）EcoRIrecognitionsites phageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNADNA重组的一般步骤1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起
2、增殖。4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。1.至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。2.至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。3.至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞4.安全性（一）特点基因工程载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞自主复制的DNA分子。一、载体（二）类型1、质粒载体常用的克隆载体、双链环状的DNA分子（也有线性的）、能独立地自我复制及转录。作为克隆载体的质粒应具备以下特点:分子量小，稳定存在，较高拷贝数；遗传标志；内切酶点。（1）pBR
3、322质粒载体123来源于pSF2124质粒转座子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tertr）来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）（2）pUC质粒载体氨苄青霉素抗性基因(ampr)，大肠杆菌-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码-肽链的DNA序列位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点(MCS)区段，它并不破坏该基因的功能。来自pBR322质粒的复制起点（ori）（3）pGEM-3Z质粒2、噬菌体 （1）噬菌体的生物学特性溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的
4、组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。(烈性噬菌体只具有溶菌生长周期)溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。(温和噬菌体具有溶源生长周期和溶菌生长周期)（2）噬菌体A. 生物学特性 组成：蛋白质外壳和线状双链DNA分子组成。 DNA长度为48502bp，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos位点（cohesive end site）。 温和噬菌体一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶
5、菌生长周期。 复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶菌周期的早期是“”复制，晚期进行滚环复制 基因组成DNA至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约13为非必须区段。 B. 类型插入型 （Insertion vectors ）这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。如：gt10 、 gt11 克隆能力小，不到10kb置换型 （Replacement vectors）这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的DNA区段是噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如Charon 4 载体克隆能力大，2025kb（3）
6、M13噬茵体A. 生物学特性B. 单链闭合环状噬菌体只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组DNA长约6.4kb，可分为10个区和507 bp基因间隔区（IS区），该区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于单链DNA载体的重要前提。复制与增殖进入细胞内部的M13（）链DNA，便起到一种模板的作用，合成出互补的（一）链 DNA。由此形成的双链形式的M13DNA，称为复制型 DNA。它按形式进行几轮复制之后，基因 的产物便在RFDNA的正链待定位点上作切割反应，形成一个缺口。这样，M13基因组的扩增活动便正式开始启动。其基本特点是利用大肠杆菌的DNA聚合酶I，以环形的MI
7、3（一）DNA为模板合成 M13（）DNA。当DNA复制叉沿着模板DNA分子转移到复制终点时，在基因编码产物的作用下，新合成的（十）DNA便会被切除下去，并进一步环化形成单位长度的 M13基因组DNA 3、柯斯质粒载体柯斯质粒(cosmid)又称粘粒，是由DNA的cos区与质粒重新构建的载体，具有质粒相同的结构特点，为双链、环状DNA。“cosmid”一词是由英文“cos site-carrying plasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点的质粒。因此我们说，所谓柯斯质粒其实是一类由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。 柯斯质粒具有下列特点： 具有质
8、粒载体的特性。 带有噬菌体的粘性末端(cos区)。 一个或多个酶切位点。 具有高容量的克隆能力。 非重组体粘性质粒很小，不能在体外包装，因而有利于重组体的筛选。 4、病毒载体类型：1、重组型病毒载体 2、无病毒基因的病毒载体 复制缺陷型 可复制型 复制缺陷型组成：1、病毒复制和包装元件 2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 4、病毒外壳/外膜 常用的病毒载体的特点：病毒载体生物学特性适用范围反转录病毒载体 单链RNA病毒 810kb可感染分裂细胞；整合到染色体中；表达时间较长；有致癌的危险；Ex vivo基因治疗；肿瘤基因治疗。腺病毒载体 双链DNA病毒 36kb可感染分裂和非分裂细胞；不整
9、合到染色体中；外源基因表达水平高；表达时间较短；免疫原性强；In vivo基因治疗；肿瘤基因治疗；疫苗。AAV病毒载体 单链DNA病毒 5kb可感染分裂和非分裂细胞；整合到染色体中；无致病性；免疫原性弱；可长期表达外源基因；在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组织中表达较高；In vivo 基因治疗；Ex vivo基因治疗；遗传病基因治疗；获得性慢性疾病的基因治疗。HSV病毒载体 双链DNA病毒 152kb具有嗜神经性；可逆轴突传递；可潜伏感染；容量大；可感染分裂和非分裂细胞；神经系统疾病的基因治疗；肿瘤的基因治疗。优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 2、复杂的装配过程由细胞完成；
10、 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。二、质粒DNA的提取1、细菌的收获含相应抗生素的液体培养基里培养1.5ml离心管离心沉淀细胞2、细菌的裂解（1）碱裂解法（2）煮沸法（1）碱裂解法碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是根据Birnboim和Doly（1979）以及Ish-Horowicz和Burke（1981）的方法修订而成。优点：收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。基本原理：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈
11、絮状，离心时可沉淀下来。用酒精沉淀法可以收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。三、质粒DNA的纯化上清液加
12、入固体CsCl与EtBr溶液室温下超速离心(45,000rpm）16小时穿孔取出DNA（320nm）异丙醇抽提溴乙锭缓冲液透析除去残余CsCl两倍体积冷乙醇沉淀DNA离心、洗涤、干燥氯化铯密度梯度离心法实验表明，在细胞裂解及DNA分离的过程中，大分子量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完整的状态。这种差别对质粒DNA的纯化是十分有用的。缺点 通过氯化铯-EtBr密度梯度离心法虽然可以得到高纯度、高质量的质粒DNA，但它操作复杂，需要价格昂贵的氯化铯和超速离心机设备，而且溴化乙锭又是一种致癌物质，如果操作不慎，不仅会造成环境污
13、染，还会危及实验工作人员的身心健康。 根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、型三大类。 类和类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。 类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。 类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。 故类和类酶在基因工程中基本不用。1、限制酶的类型四、DNA酶切型酶 型酶就是通常指的限制性内切酶. 它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段； 型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一
14、般为个碱基对的反转重复顺序； 型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出；端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。（一） DNA的连接1、DNA连接酶T4 DNA连接酶（需要ATP作为辅助因子）主要用于：（1）连接具有同源互补粘性末端的片段；（2）双链DNA分子间的平端；（3）在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。2、粘性末端连接连接后可能出现以下问题：（1）载体自身环化，造成假阳性背景克隆，为避免此问题，可在连接前，用碱性磷酸酶将载体DNA 5- 端去磷酸化，这样只有载体和插入片
15、段之间才能发生连接；（2）插入片段可双向插入；（3）插入片段可多拷贝插入。五、DNA的连接和转化3、平端连接平端连接的优点是可用T4连接酶连接任何DNA平端，这对不同DNA分子的连接十分有利。平端连接的主要问题是，它的连接效率比粘性末端低，因此需较多的T4 DNA连接酶和较高的底物浓度，聚乙二醇（）可促进平端连接反应。4、人工接头连接5、利用适配子连接（二）重组DNA的转化1、转化指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化
16、效率高、适用于任何菌株。（1）将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。步骤：（2）与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。（3）立即将该体系转移到42下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。（5）涂布于选择性培养基中分离转化子。（4）在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复2、转染和感染感染：在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。转染：在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。 （一）抗药性标志的筛选（二）半乳糖苷酶系统筛选（三）菌落快速裂解鉴定法（四）内切酶图谱鉴定（五）通过聚合酶链反应筛选重组子（六）菌落或噬菌斑原位杂交六、重组质粒的筛选和鉴定第四节分子杂交技术杂交(hybridization) ：来源不同的两条彼此的链重新缔合成为双螺旋结构的过程。（注意与复性的区别）在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且
