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1、4.5 细菌的遗传分析与基因定位4.5.1细菌的转化和基因定位转化：指某些细菌能通过其细胞膜摄取周围供体的染色体片段，将此外源DNA片段通过重组加入自己染色体组的过程。1928年，格里费斯(Griffith F.)在肺炎双球菌中发现转化现象。1944年，阿委瑞(Avery O. T.)成功地进行了肺炎双球菌转化试验；证实遗传物质是DNA；转化是细菌交换基因的方法之一。 细菌中的大部分的转化工作是用下面三种细菌完成的：肺炎双球菌，枯草杆菌和流感嗜血杆菌。转化主要分为二个步骤进行:(一)供体DNA与受体细胞间的接触与互作 肺炎双球菌转化：DNA片断至少有800个碱基对；枯草杆菌的转化：DNA片断至
2、少有16000个碱基对。 转化的第一步是使转化DNA与受体细菌间的成功地相互作用，这包括：转化片段的大小、形态、浓度和受体细胞的生理状态。 .转化片断的大小：.供体DNA分子存在的数目：对特定基因来说，供体DNA分子数目与成功转化有关。链霉素抗性基因转化：在每个细胞含有10个DNA分子之前，抗性转化体数目一直与DNA分子存在数目成正比。原因：在细菌的细胞壁或细胞膜上有固定数量的DNA接受座位，故一般细菌摄取的DNA分子数小于10个。受体的生理状态：受体细胞必须在生理上处于感受态。 这种感受态只能发生在细菌生长周期的某一时间范围内，在感受态内，活跃合成的蛋白质的细菌细胞壁多少发生改变而易于接受转
3、化DNA。 (三)转化和基因重组作图 例如：黎德伯格等用枯草杆菌进行转化和重组试验 DNA 片段进入受体细胞之后，可与受体染色体发生重组。紧密连锁的两个基因有较多的机会包括在同一个DNA片段中，并同时整合到受体染色体中。Trp2 his2 tyr1 三者并发转化的频率最高，故这3个基因是连锁的，其中his2和tyr1连锁紧密：单交换时，染色体开环易降解，故不存在单交换类型；只有双交换和偶数的多交换才有效的。4.5.2细菌的接合和基因定位1.接合：是指原核生物的遗传物质从供体(donor)转移到受体(receptor)内的过程。特点：需通过细胞的直接接触。B菌株：Met+ bio+ thr- l
4、eu-，需加苏氨酸和亮氨酸。不同营养缺陷型的大肠杆菌： A菌株：Met- bio- thr+ leu+，需加甲硫氨酸和生物素。4.5.2.1黎德伯格和塔特姆（1946年）：A菌株和B菌株营养缺陷型，不能在基本培养上生长。A+B菌株混合培养，在完全培养基上，几小时后离心，涂布基本培养,长出原养型(Met+bio+ thr+ leu+)菌落。这种原养型细胞如何出现？转化？ 细胞间直接接触而发生遗传物质交换和重组? A、B菌株分别培养在基本培养基上 一边加压和吸引使培养液充分混合 结果任何一臂的培养基上均未长出原养型细菌。直接接触(接合)是原养型细胞出现的必要条件。大分子可通过，细菌不能通过Haye
5、s(1952)试验证明：接合过程是一种单向转移，A菌株遗传物质 B菌株，从供体“donor”到受体“receptor”。F 因子：致育因子(性因子)，是一种附加体。携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F表示。未携带F因子的菌株为受体菌或雌性，用F表示。5.4.2.2细菌遗传物质的转移是单向的F 因子的组成：染色体外遗传物质，环状DNA； 40-60个蛋白质基因；2-4个/细胞(雄性内)。 4.5.2.3F 因子的三种状态：以大肠杆菌为例：一个自主状态F因子，即F； 带有一个整合的F因子的细胞叫高频重组细胞，Hfr细胞。没有F因子，即F；自主状态时F 因子独立进行分裂。FF：先形成接合管，F因子
6、的DNA边转移边复制，F细胞 F细胞。F因子整合到细菌染色体上(F Hfr细胞)，其繁殖与细菌染色体同步进行。此时，细菌基因的重组频率增加4倍以上，因此染色体上整合有F因子的菌株，称为Hfr菌株。、Hfr细胞的形成及染色体的转移：细菌染色体由一小段单链的F因子为前导而转移到F-受体 边进入边合成。一般情况下仅小部分细菌染色体能够转入，接合中断 受体细胞仍为F，F因子仍留在供体内。部分二倍体中发生交换:单数交换：打开环状染色体，产生一个线性染色体，这种细胞是不能成活的。偶数交换：产生可遗传的重组体和片段。部分二倍体：当F或Hfr的细菌染色体进入F后，在一个短时期内，F细胞内的某些位点就会成为二倍
7、体的DNA。4.5.2.5中断杂交作图中断杂交：就是将两个菌株（例如Hfr a+ strsF- a- strr）在培养液中进行通风培养，每隔一定时间取样，把菌液放入组织捣碎器里搅拌以中断杂交，经过稀释接种到鉴别培养基上，待形成菌落后鉴定它们的基因型。 1955年Wollman和Jacob首次进行中断杂交实验：供体菌：HfrH strs thr+ leu+ azis tons lac+ gal+受体菌： F- strr thr leu- azir tonr lac- gal-将大约10倍的F-菌与 Hfr对数期菌混合，轻轻振荡培养在不同时间间隔取样，然后在组织搅拌中剧烈振荡,中断杂交振荡后的培养
8、物涂布于加了链霉素的基本培养基上筛选不同于两个亲本的thr+ leu+ strr重组子再对每一个重组子的非选择性标记azi ton lac gal 进行测定。 azi：叠氮化钠抗性， ton：噬菌体T1抗性n中断杂交实验过程n中断杂交实验结果n（1）不同的非选择标记进入受体且重组的时间不同，但都是稳定的；n（2）各基因的重组频率随着时间的增加而增加，直至极值；n（3）按时间顺序，先重组和后重组的基因，重组率的极值在逐步减少；该方法主要根据基因转移的先后次序，以时间为单位，求基因间的遗传距离。n利用中断杂交实验作图 大肠杆菌染色体是环形的u不同Hfr菌株进行中断杂交实验，基因转移的顺序、起点和转
9、移方向各不相同。 u推断大肠杆菌的染色体为环形，而F因子在细菌染色体上有许多插入位点，且插入方向不同。Hfr H o thr azi lac tsx gal trp mal xyl metB thi F C o tsx lac azi thr thi metB xyl mal trp gal F J4 o thi metB xyl mal trp gal tsx lac azi thr F P72 o metB thi thr azi lac tsx gal trp mal xyl F Trp malGal xyltsx metB lac thi azi thr C P72 H J4细菌染色体
10、为环状细菌染色体为环状 当转移时间间隔在两分钟之内， 如已知lac与ade紧密连锁，距离约为1分钟，中断杂交作图就不可靠，须用传统的重组作图(recombination mapping)。紫红色菌落：lac+ade+ 780（亲本型）白色或粉红色菌落：lac- ade+ 220（重组型）Hfr: lac+ade+strs X F-: lac-ade-strr 混合60min F-：ade+strr 1000 MM+str影印EMB五、重组作图 二个基因紧密连锁:lac-：乳糖不发酵 ade-：腺嘌呤缺陷型1、 重组子的产生lac- ade+ strrlac+ ade+ strrlac+ ade
11、+ strs lac- ade- strrlac- ade- strslac+ ade+ strs lac- ade- strrlac+ ade- strs 2、 重组频率的计算1分钟相当于20%重组值，即：1min=20cMRFlac-ade = *100% lac-ade+ lac+ade+lac-ade+ = *100%=22%=22cM 220 1000 3、大肠杆菌的遗传图谱图距单位：分钟总长度：100分钟起点（0分钟） ：thr座位大肠杆菌的环形遗传学图4.5.3细菌的转导和作画n1.定义：以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质重组的过程，称转导。n2.发现Lederbery及其研究生
12、Zinder（1951）首先在鼠伤寒沙门氏菌（Salmenellatyphimurium）中发现转导现象。发现过程他们用苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌和甲硫氨酸、组氨酸营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌共同培养，相当让两种不同缺陷型的菌杂交。杂交过程和结果如下： LT22phe-try-tyr-LT2met-his-（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸）（甲硫氨酸、组氨酸）营养缺陷型营养缺陷型原养型的菌落（即出现个别正常型的细菌）n那么这些原养型菌落的出现是由接合引起的？还是由转化引起的？他们先进行U形管实验（P159），结果在LT22一臂获得原养型的菌株，由此推测可能有一种可通过滤膜的过滤
13、性因子（FA）在起作用。进一步利用DNA酶处理，结果FA不受DNA酶影响，从而消除了转化作用的可能性。最后认为FA是一种噬菌体，发现了转导。n3.转导的机制转导是在噬菌体包装中因为错误将细菌染色体片段包装进去成为内含细菌染色体片段“假噬菌体”而发生的。具体过程如下：（1）噬菌体侵染细菌。（2）噬菌体DNA使细菌染色体形成片段，合成噬菌体DNA和外壳。（3）新噬菌体包装，偶尔将细菌染色体片段也包装进去成为内含细菌染色体片段“假噬菌体”。“假噬菌体”和真噬菌体一起释放出来。 （4）“假噬菌体”和真噬菌体一样可再侵染细菌，其中“假噬菌体”侵染时，就将外来的细菌基因注入，经过基因重组改变遗传性状，完成
14、转导的过程。目前根据转导的机制，已广泛应用在体外包装“假噬菌体”，即将外源基因导入“假噬菌体”中，再侵染细菌，进行基因表达的研究。n1.普遍性转导普遍性转导：指P1、P22等可以转导沙门氏菌染色体组的任何不同的部分。如果两个基因始终是一起转导或同时转导（共转导或并发转导）频率较高，那么证明两基因连锁，而且频率越高，则两基因距离越近。n如：a基因和b基因共转导频率高，a和c共转导频率也高，b和c共转导频率低，则3个基因顺序为bacn若同时观察3因子转导分析，则只做一次实验就可推出其次序。举例：利用普遍性转导测知leu，thr，azi三个基因顺序。方法：（1）用噬菌体P1侵染带leu+，thr+和
15、azi+的大肠杆菌。（2）用从该大肠杆菌释放出来的噬菌体，再侵染leu-、thr-和azi-的大肠杆菌。 (3)把受体菌接种到不含thr的选择培养基上对thr+进行选择，凡具thr+的细菌都可生长，把此菌接种到其他培养基上，结果在选出的thr+重组子只有3%leu+，但无一个同时也是azi+。若选择leu+重组子，则约有50%同时也是azi+，因此3基因次序应为thr+leu+azi+。P1652.特异性（局限性）转导概念：只能转移细菌染色体特定部分基因的转导. 2 局限性转导的过程 3 转导的机制:是因为噬菌体在细菌染色体的特定位 点上整合。 4 低频转导与高频转导 噬菌体 感染供体菌裂解液
16、(转导噬菌体)非溶源 (溶源菌) (10-6) 性细菌溶源性转导子重组性转导子低频转导：指溶源性细菌经诱导所释放的噬菌体所 进行的转导.4.6 噬菌体的重组作图n4.6.1噬菌体的结构和形态二噬菌体n1951年 Esther Lederberg 发现K12中有原噬菌体，并命名为。n附加体(episome)n合子诱导（zygoticinduction） Hfr（） F 无重组子Hfr F（） 有重组子 4.6.2噬菌体的重组作画n菌苔（lawn）n噬菌斑（plaque）四、T2的环形遗传图噬菌体的DNA环状排列与末端重复n一、线性DNA具有环状遗传图 末端重复也称末端冗余：是指T4或T2双链DNA分子两端带有相同的碱基序列。 环状排列又称致环交换。1）感染初期 2）感染后期环状排列与末端重复的形成
