《酶工程第五章酶改性的基本理论——酶的结构及其与催化特性的关系2013-2教学案例》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶工程第五章酶改性的基本理论——酶的结构及其与催化特性的关系2013-2教学案例（128页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、酶工程酶工程EnzymeEngineeringEnzymeEngineering林范学1 1/50/501 1第二篇酶的改性 酶的改性（enzyme improving）：通过各种方法使酶的催化特性得以改进的技术过程 酶的改性的目的 提高酶的催化效率催化效率 增加酶的稳定性稳定性 降低或消除酶的抗原性抗原性 提高酶的使用效率使用效率（反复或连续使用酶） 扩大酶的使用范围使用范围（研究酶在水溶液以外的条件下进行催化反应的特性和条件） 酶的结构与功能的关系研究研究 常用的方法:酶分子修饰（enzyme molecule modification） 酶分子定向进化（enzyme molecule d
2、irected evolution）酶固定化（enzyme immobilization）酶非水相催化（enzyme catalysis in non-aqueous phase）第一节 酶的化学组成酶蛋白类酶蛋白质酶蛋白核酸类酶RNA酶RAN氨基酸（20种）核苷酸（4种）一、蛋白类酶的基本组成单位氨基酸u氨基酸结构u肽键二、核酸类酶的基本组成单位核苷酸u碱基+核糖+磷酸=核苷酸u3,5-磷酸二酯键5AMP5GMP5UMP5CMP三、酶的辅因子u单成分酶：仅有蛋白质或核糖核酸组成的酶u双成分酶：除了蛋白质或核糖核酸外，还有其他非生物大分子成分的酶。全酶holoenzyme无催化活性有催化活性酶
3、蛋白辅因子（cofactor）酶RNA辅因子（cofactor）+决定专一性传递电子、原子或某些化学基团1. 无机辅因子u金属离子的作用： 参与催化反应 、稳定酶的构象。元素主要生物化学功能硒 谷胱甘肽过氧化物酶和其他酶类的辅因子铁 血红素酶（过氧化氢酶，细胞色素氧化酶）的辅基铜 细胞色素氧化酶的辅酶锌 脱氢酶类，DNA聚合酶，碳酸酐酶的辅因子锰 精氨酸酶和其他酶的辅因子钼 黄嘌呤氧化酶的辅因子镍 脲酶的辅因子钒 硝酸还原酶的辅因子u无机辅助因子主要是指各种金属离子，尤其是各种二价金属离子。（1）镁离子 镁离子是多种酶的辅助因子，在酶的催化中起重要作用。例如，各种激酶、柠檬酸裂合酶、异柠檬酸脱
4、氢酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、各种自我剪接的核酸类酶等都需要镁离子作为辅助因子。1. 无机辅因子（2）锌离子 锌离子是各种金属蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶等的辅助因子，也是铜锌-超氧化物歧化酶（Cu，Zn-SOD）、碳酸酐酶、羧肽酶、醇脱氢酶、胶原酶等的辅助因子。（3）铁离子 铁离子与卟啉环结合成铁卟啉，是过氧化物酶、过氧化氢酶、色氨酸双加氧酶、细胞色素B等的辅助因子。铁离子也是铁-超氧化物歧化酶（Fe-SOD）、固氮酶、黄嘌呤氧化酶、琥珀酸脱氢酶、脯氨酸羧化酶的辅助因子。（4）铜离子 铜离子是铜锌-超氧化物歧化酶、抗坏血酸氧化酶、细胞色素氧化酶、赖氨酸氧化酶、酪氨酸酶等的辅助
5、因子。（5）锰离子 锰离子是锰-超氧化物歧化酶（MnSOD）、丙酮酸羧化酶、精氨酸酶等的辅助因子。（6） 钙离子 钙离子是-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的辅助因子。2. 有机辅因子u是指双成分酶中相对分子量较小的有机化合物。它们在酶催化过程中起着传递电子、原子或基团的作用。 (1)传递电子体：如 卟啉铁、铁硫簇； (2)传递氢（递氢体）：如FMN/FAD、NAD+/NADP+、CoQ、硫辛酸； (3)传递酰基体：如 CoA、TPP、硫辛酸； (4)传递一碳基团：如 四氢叶酸； (5)传递磷酸基：如 ATP，GTP； (6)其它作用： 转氨基，如 磷酸吡哆醛（VB6） ；传递CO2，
6、如 生物素。(1) 烟酰胺核苷酸(NAD+， NADP+)uB族维生素u许多脱氢酶的辅因子：乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶uNAD+：烟酰酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅辅酶Il一般与呼吸链相连，与分解反应偶联：（醇脱氢酶催化伯醇脱氢生成醛）lRCH2CH2OH+NAD+=RCH2CHO+NADH+H+uNADP+：烟酰酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅辅酶 。l一般与合成反应相偶联。(2) 黄素核苷酸(FMN和FAD)u维生素B2(核黄素)的衍生物u各种黄素酶(氨基酸氧化酶、琥珀酸脱氢酶等)的辅助因子uFMN：黄素单核苷酸uFAD：黄素腺嘌呤二核苷酸lFMN和FAD的主要作用是传递氢。(3
7、)铁卟啉u铁卟啉是一些氧化酶（如过氧化氢酶、过氧化物酶等）的辅助因子。l它通过共价键与酶蛋白牢固结合 。(4)硫辛酸u 硫辛酸全称为6,8-二硫辛酸。它在氧化还原酶的催化作用中，通过氧化型和还原型的互相转变而起传递氢的作用 。(5)核苷三磷酸(NTP)u腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、鸟苷三磷酸(CTP)、胞苷三磷酸(CTP)、尿苷三磷酸(UTP)等。它们是磷酸转移酶的辅助因子。 (6)鸟苷u鸟苷是含型IVS的自我剪接酶(R-酶)的辅助因子。(7) 辅酶Qu辅酶Q是一系列苯醌衍生物u一些氧化还原酶的辅助因子。(8) 谷胱甘肽(GSH)uL-GluL-IleL-Gly三肽(9) 辅酶A （CoA）u
8、辅酶A是各种酰基化酶的辅酶，由一分子腺苷二磷酸、一分子泛酸和一分子巯基乙胺组成。(10)生物素u生物素是维生素B的一种，又称维生素Hu生物素是羧化酶的辅助因子，在酶催化反应中，起CO2的渗入作用。(11) 硫胺素焦磷酸(TPP)u即维生素B1，是酮酸脱羧酶的辅助因子。 (12)磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺u即维生素B6，是各种转氨酶的辅助因子。u在酶催化氨基酸和酮酸的转氨过程中，维生素B6通过磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺的互相转变，起到氨基转移作用第二节 酶的化学结构一、酶蛋白的化学结构u即一级结构，是指蛋白质中的氨基酸按照特定的排列顺序通过肽键连接起来的多肽链结构。 l氨基酸的种类和数目l氨基酸的排列次
9、序l二硫键的数目和位置l肽链的数目等。u每种蛋白质都由唯一而确定的遗传信息决定氨基酸序列u一级结构决定蛋白质的高级结构u氨基酸：20种AA的结构特点-AA；除Gly外都具有光学性(有D-和L-型两种光学异构体)。结构通式:不带电形式 H2NCHCOOHR +H3NCHCOO-R两性离子形式l-氨基酸赖氨酸lL-型和D-型丙氨酸levorotatorydextrotatoryu肽：一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而成的化合物。l肽键（peptide bond）：一个氨基酸的-COOH 和相邻的另一个氨基酸-NH2脱水所形成的共价键。l肽单位：CN，半双键性（partialdoub
10、le-bondcharacter），不能旋转CC、NC，真正单键（puresinglebond），可以旋转l二硫键：2个Cys的巯基脱氢联结而成SSSSSS肽链内二硫键肽链间二硫键牛胰核糖核酸酶一级结构胰凝乳蛋白酶chymotrypsinu酶蛋白化学结构的测定（1）酶蛋白的分离纯化（纯度97）u沉淀、离心、电泳、层析等等（2）氨基酸种类和数目的确定u蛋白质水解后用层析技术等分离鉴定。氨基酸自动分析仪（3）肽链数目的确定u通过末端分析等方法测定肽链的数目u通过还原法打开二硫键l在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基
11、，防止重新被氧化。（4）氨基酸顺序测定u酶蛋白不完全水解各种小肽末端分析综合分析u末端分析u二硝基氟苯（FDNB）法（N-末端分析）FDNB+肽pH8.5-HFDNP肽HCl水解DNPAA+其他AANO2FNO2FDNBNO2NHNO2NO2NHNO2PolypeptideDNBderivativeofPolypeptideDNBderivativeofN-termimalresidueFreeAA6MHCl+HFu肼解法（C-末端分析）氨基酸酰肼二亚苄衍生物（不溶于水）二、酶RNA的化学结构u酶RNA的化学结构主要包括组成RNA的核苷酸种类、数目和排列顺序。l4种核苷酸：AMP，GMP，CM
12、P，UMPl3-5磷酸二酯键连接u酶RNA化学结构的测定l核酸自动测序仪u高通量测序（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（“Next-generation” sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。l大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)l聚合酶克隆（Polony Sequencing）l454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）lIllumina (Solexa) sequencin
13、glABI SOLiD sequencingl离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）lDNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing）等。l传统方法:(1)酶RNA的分离纯化，得到较纯的RNA样品(2)将RNA水解成各种核苷酸，确定核苷酸的种类和数量(3)用特异性酶切法或双脱氧终止法进行RNA序列测定第三节 酶的空间结构u酶蛋白的空间结构：二、三、四级结构u酶RNA的空间结构：二、三级结构一、酶蛋白的空间结构u包括二级结构、三级结构、四级结构u基本结构单位：螺旋、折叠、转角、卷曲等结构1、酶蛋白的副键（1）氢键: 肽键中羰基的氧原子等与
14、亚氨基、羟基、氨基等基团中氢原子联结成的副价键（2）盐键：蛋白质分子中氨基与羧基形成，结合力较强（3）酯键：蛋白质分子中羧基与氨基酸上的羟基脱水而缩合而成（4）二硫键：由蛋白质分子上两个半胱氨酸残基上巯基通过氧化脱氢而成，对蛋白质稳定性起重要作用R1SSR2（5）疏水键：蛋白质分子中疏水性较强的侧链基团聚集而成，对稳定蛋白有一定作用；（6）范德华力：借助静电引力而形成，键能较小（7）金属键：通过金属离子与蛋白质中基团联结而成，维持蛋白质空间构型有一定作用，在四级结构中联结亚基。CopperchaperoneproteinPcoC铜伴侣蛋白2、酶蛋白的二级结构 u主要指多肽键主链原子的局部空间排
15、列，一般不考虑侧链的构象。u包括：l-螺旋结构l-片层结构l-转角结构l无规卷曲（1）-螺旋结构u-螺旋结构是由蛋白质的肽链环绕中心轴有规则一圈一圈盘旋而成。l右手螺旋（-helix）螺距为0.54nm,含3.6个AA残基两个AA之间的距离为0.15nm；AA残基侧链伸向外侧，相邻的螺圈之间形成链内氢键；主要靠氢键维持-螺旋有左旋和右旋两种，右旋比左旋更加稳定，因此也更常见。（2）-片层结构(pleated sheet)u又称-折叠，是两条或多条肽链充分伸展成锯齿状的折叠结构，通过侧向聚集，形成与肽链长轴方向平行的折扇状构象。u肽链几乎完全伸展，通过链间的氢键交联维持结构；u肽链的主链呈锯齿状
16、折叠构象，R基团处于折叠平面的两侧。平行式反平行式（3）-转角结构（turn）u又称转弯或发卡结构，是在球蛋白中发现。u球状蛋白的多肽链经常出现180的回折，这个回折角就是转角结构；u它由四个AA残基组成;u回折处的第一个AA残基的 -C=O 和第四个AA残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结。u-转角结构中常出现的AA有Gly、Pro、Asp、Asn、Trp等（4）无规卷曲（nonregular coil）u又称自由回转（random coil)，是肽链的主链不规则、多向性地随机盘曲所形成构象。在同一种蛋白质中，无规卷曲出现的部位和结构完全相同（有规律）不同蛋白质中或同一蛋白中不同肽段中，无规卷曲形式多样（无规律）通常酶的活性中心常处在这一构象区域里。转角折叠螺旋无规卷曲3、超二级结构和结构域u超二级结构(supersecondary structure，Motif)：是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。u， 。u超二级结构- 花式-loop- 花式-loop- 花式u结构域（domain） ：是在超二级结构基
