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1、第七章 真核细胞内膜系统、蛋白质分选与膜泡运输 第一节 细胞质基质(cytosol) 1、定义:除去可辩识细胞器后的胶态物 2、组成:各种酶,胞质骨架 3、高度有序 4.细胞质基质的基本功能 1)中间代谢的场所。糖酵解、磷酸戊糖途径、糖醛酸途径、糖原合成 2)为细胞器提供所需离子环境 3)为细胞器行使功能提供底物。 4)细胞质骨架：提供锚定位点，各种组分区域化. 5)参与蛋白质修饰、选择性降解等一、ER的形态 ER膜是细胞中最多的膜，占总膜面积一半。 ER是密闭的网状管道系统，具多型性。 ER膜围成的腔是相互连通的统一体。 分糙面型内质网(RER)和光面型内质网(SER)。RER呈扁平囊状，排
2、列整齐，有核糖体附着SER呈分支管状或小泡状，无核糖体附着。 RER功能是合成各种蛋白，分泌旺盛细胞中较多，未分化细胞和肿瘤细胞中较少。 SER是脂类合成场所，常为出芽位点，将合成蛋白质和脂类物质运到高尔基体 SER是ER管道网络的一部分特化的SER: 肌质网(sacroplasmic reticulum) 肌细胞中特化SER。膜上的Ca2+-ATP酶将胞质中的Ca2+泵入腔中储存，使肌质网中Ca2+浓度比胞质中高出千倍。受神经冲动的刺激时，Ca2+释放入胞质中，引起肌肉收缩。二、 ER的组成 ER膜含约60%蛋白和40%脂类，脂中磷脂酰胆碱含量高，鞘磷脂含量低，胆固醇少。 ER约有30多种膜
3、结合蛋白，30多种位于内质网腔。标志酶是葡糖-6-磷酸酶。 核糖体结合糖蛋白只分布在RER. P450酶系只分布在SER。 RER膜上有易位子(translocon)，直径约8.5nm，有2nm通道，与新合成多肽转运有关。 细胞匀浆时，由破碎ER形成的近球型的囊泡结构,称为微粒体(microsome)，含ER膜与核糖体。研究中将其与ER等同对待。三、ER的功能 合成蛋白质和脂类。分泌蛋白和跨膜蛋白都在ER合成。 合成的脂类除满足自身需要，还供给高尔基体、溶酶体、内体、质膜、线粒体、叶绿体等膜性细胞结构。 (一)SER的功能 SER具许多功能，如糖原分解，类固醇激素合成，脂肪合成与转运，肝细胞解
4、毒，肌肉收缩等 。1、糖原分解释放游离的葡萄糖 肝细胞功能之一是维持血液Glu的衡定：肝细胞SER表面附有糖原颗粒，肌体需Glu时，糖原被转化为G-1-P，变为G-6-磷酸。膜对磷酸化糖不通透，G-6-P 需要通过SER中的G-6-Pase去磷酸化变成葡萄糖后才穿过质膜，进入血液。2、类固醇激素的合成 分泌类固醇激素的肾上腺细胞、黄体细胞等都有丰富SER。SER上分布有合成胆固醇和转化胆固醇为激素的全套酶系，合成胆固醇，并将其氧化、还原、水解成各种类固醇激素。3、脂的合成与转运 SER是脂类合成主要场所。甘油三酯是由SER合成并贮存ER腔中。 细胞膜所需的膜脂全都在SER合成， SER上有合成
5、磷脂所需的酶。 SER合成的磷脂由胞质面转向ER腔面，转位由ER膜中翻转酶帮助完成。SER合成磷脂向其它膜结构转运的2种方式： 1. 通过水溶性载体蛋白-磷脂交换蛋白(PEP)，在膜结构间转移磷脂：PEP与磷脂结合形成水溶性复合物进入cytosol，扩散遇上其它膜后，PEP释放磷脂，将它插在膜上。 2. 以出芽方式将磷脂转运到高尔基体、溶酶体和细胞膜。4、解毒作用 肝细胞中的SER对农药、污染物、毒素等有毒物具解毒作用。也称肝细胞的解毒作用。 Cyt P450是肝细胞SER的膜蛋白，属单加氧酶，或羟化酶。它催化O2中的1个氧原子加到不溶于水的废物上使之羟化，溶于水并被转出细胞；另一氧原子被NA
6、DH还原成水。 5、钙离子的调节作用 肌细胞有发达的肌质网,是肌细胞钙库,含钙结合蛋白,1个钙结合蛋白结合30个左右Ca2+ 。 细胞受刺激时，肌质网中Ca2+释放进入胞质，参与信号传递；信号消除时， Ca2+又被肌质网上的Ca2+-ATPase泵回腔中。 多数真核细胞中，ER是主要Ca2+库之一。且ER膜上有三磷酸肌醇(IP3)的受体。 （二）RER的功能-蛋白质转运 游离核糖体合成的蛋白质：胞浆蛋白,膜外周蛋白和锚定蛋白,过氧化物酶体蛋白,核蛋白等. RER结合核糖体合成的蛋白质： 分泌蛋白、如激素； 跨膜蛋白，并决定膜蛋白在膜中排列方式; 需严格分开的酶，如溶酶体的水解酶； 需进行修饰的
7、蛋白，如糖蛋白。 为什么有些核糖体要附着在ER上合成蛋白质?是什么原因决定了核糖体在合成蛋白质时是游离还是附着到ER？ 1. RER核糖体合成的蛋白质进入ER腔 60s，Redman将RER小泡置加放射性标记aa的蛋白质合成体系中短暂温育，再加嘌呤毒素，蛋白质合成提前终止,从核糖体上释放不完全多肽 收集RER小泡，去垢剂破坏,分析表明，RER小泡中释放的多肽含放射性标记. 证明新合成的多肽能跨过ER膜进入ER腔2.信号序列的提出 是什么原因指导这些多肽跨过ER膜的呢？ 1971年美国Blobel等提出了两点推测： 1）分泌蛋白的N端含一段特别的信号序列可将多肽和核糖体引导到ER膜上； 2）多肽
8、通过ER膜上的转运蛋白进入ER腔，并在合成的同时转移。3. 信号序列存在的实验证据 72年，Milstein等用无细胞系统合成IgG轻链时，获得了信号序列存在的直接证据。 在无细胞体系中用编码IgG轻链的mRNA指导合成多肽，合成的多肽比成熟的IgG在N端多出一段肽链，有20个aa，推测，这段肽具信号作用，使IgG透过ER并继而分泌到细胞外。Blobel等用微粒体和无细胞体系进行大量研究，证实了信号序列的存在。(1)在无细胞体系中加与不加RER小泡，蛋白质合成的产物不同：将分泌蛋白的mRNA在无细胞体系中翻译时，如不加RER小泡，获得的翻译产物的长度比从细胞中分泌出的蛋白质长。如在这种无细胞体
9、系中添加RER小泡，翻译产物与从细胞中分泌出来的蛋白质长度相同。推测信号序列在引导蛋白质进入后被切除(2)蛋白水解酶实验证明多肽在合成的同时就开始向ER转运： 在分泌蛋白进行体外翻译的无细胞体系中(含有RER小泡)加蛋白水解酶，不能使新合成多肽水解。如同时加入去垢剂，则能将蛋白质水解，说明新生肽链是边合成边运输的。 4. 信号序列的一般特征及信号假说 Blobel还发现信号序列具共同特性： 一般为15-35个aa残基，N端含有1或多个带正电荷的aa，其后是6-12个连续的疏水aa； 这些信号序列在蛋白质合成时将核糖体引导到ER，进入ER后被切除。 1975年，Blobel正式提出信号假说,其要
10、点： 1)蛋白的合成起始于胞质中游离核糖体 2)N端信号序列露出核糖体后，靠自由碰撞与ER接触，N端信号序列的疏水性插入ER膜中； 3)蛋白质继续合成，以絆环形式穿过ER膜 4)如果是分泌蛋白，除信号序列被信号肽酶切除外，全部进入ER腔；若是膜蛋白，则由一个或多个停止转移信号将蛋白质锚定在ER膜上。 Blobel提出的信号假说，揭示了细胞中不同蛋白质在合成后如何找到自己的工作岗位，发现了蛋白质与生俱来的“地址标签”。 该发现开辟了一个全新的医学、细胞生物学和分子生物学研究领域，为此获得1999年诺贝尔医学/生理学奖。5. 新蛋白复合物发现对信号假说补充 81年，Blobel等发现在核糖体与ER
11、结合过程还需要信号识别颗粒的参与。 信号识别颗粒(signal recognition particle，SRP)。是1种核糖核蛋白复合体，沉降系数11S，含6条不同肽链和一个7SRNA SRP有3个功能部位：翻译暂停结构域，信号识别结合位点，SRP受体蛋白结合位点。 SRP能识别并结合游离核糖体上合成的信号肽，暂时中止新生肽的合成；同时SRP能与ER上的停靠蛋白(docking protein，DP)结合，使核糖体附着到ER膜，并进行新生肽的转移。 SRP对没有信号序列的蛋白质不起作用。6. 蛋白质共翻译转运的机理 RER上合成的蛋白质有2类: A、分泌蛋白在ER合成后对信号肽的切除，可释放
12、到ER腔，成可溶性蛋白，再进行下游运输。 B、膜蛋白的共翻译转运较复杂，先要靠疏水区滞留在ER膜上；同时膜蛋白分单次和多次跨膜，还有定向。 膜蛋白的转运同样可以用信号假说进行解释。 (1)起始转移信号 蛋白质N端的信号序列除作信号被SRP识别，还具起始穿膜转移作用。 在蛋白质共翻译转移过程中，信号序列的N端始终是朝ER外侧，插入转运通道后与通道内的信号序列结合位点(受体)结合，其后的肽序列是以伴环的形式通过运输通道。 N端的起始转移序列是可切除的。 (2)内部信号序列 不位于N端，但具信号序列作用。 可作蛋白质共翻译转运信号被SRP识别，同时也是起始转移信号，可插入转运通道，与通道中受体结合，
13、引导多肽序列转运。 内部转移信号是不可切除的，同时又是疏水的，所以它是膜蛋白的一部分。 (3)终止转移肽与单次跨膜蛋白 跨膜蛋白的形成除与内部信号序列有关外，也与终止转移信号相关 终止转运信号位于新生肽中，是一段使肽链终止转移的信号序列。可使蛋白锚定在膜中。 单次跨膜蛋白在结构上只有一个终止转移序列，没有内部转移信号，但是在N端有一个信号序列作为起始转移信号。 (4)二次跨膜蛋白与多次跨膜蛋白 二次跨膜就是在蛋白质中有两个跨膜的疏水区，含1个内部信号序列和1个终止转移信号。 多次跨膜蛋白有多个跨膜的疏水区，含多个起始跨膜信号序列与多个终止转移信号。 概括起来: 新生肽是否含终止转移信号决定了新
14、生肽是成为可溶性蛋白还是膜蛋白。 N端信号序列和内部信号序列都可作起始转移信号,N端信号序列可切除,内部信号序列不可切除 跨膜蛋白的跨膜次数是由内部信号序列和终止转移信号序列的数目决定的 信号序列都是疏水aa区,可视多肽链中疏水aa区的数目和位置推测其跨膜情况蛋白质转入内质网上合成的要素及具体过程的总结(1) 要素: 至少涉及4种成分： 信号肽: 引导新合成肽链转移到ER上一段多肽,也是引导肽链进入ER腔序列,又称开始转移序列 信号识别颗粒(SRP): 与信号序列结合,导致蛋白质合成暂停. SRP受体: ER膜整合蛋白,与SRP特异结合,使核糖体泊定在ER上. 终止转移序列: 肽链上一段特殊序
15、列,与ER亲合力高,阻止肽链释放到ER腔,使其成跨膜蛋白。(2) 具体过程 游离核糖体开始合成蛋白质信号肽与SRP结合肽链延伸终止SRP与ER上的受体结合SRP脱离信号肽肽链在ER上继续合成，同时信号肽引导新生肽链进入ER腔信号肽切除肽链延伸至终止翻译体系解散。 这种肽链边合成边向ER腔转移的方式，称为cotranslation(共翻译转运)。 蛋白质转移到内质网上合成的过程7. Bip蛋白在ER蛋白质转移和装配中的作用 进入ER腔中蛋白很快与Bip蛋白结合。Bip是IgG重链结合简称，是一类分子伴侣，属Hsp70家族 Bip同进入ER蛋白的疏水aa结合，防止肽链不正确折叠和聚合，然后Bip同
16、ATP结合，并通过ATP的水解释放出结合的多肽。释放的多肽很快折叠，或同别的亚基组装成完整的蛋白质。 正确折叠和装配的蛋白不会同Bip再结合，但如折叠或装配不正确，Bip马上同其结合。8.蛋白质在ER中的修饰 新生肽进入ER腔后除要正确折叠外，还要进行各种修饰后才运送到其它部位。 这些修饰包括糖基化、羟基化、酰基化、二硫键形成等，其中最主要的是糖基化，几乎所有ER上合成的蛋白质最终被糖基化。1) 蛋白质糖基化(glycosylation)有2种： (1)N-糖基化:主要在ER进行.糖为N-乙酰葡糖胺，糖供体为核苷糖，如GDP-甘露糖。糖分子先被糖基转移酶转到膜中的磷酸长醇，再被寡糖转移酶转到肽链特定序列(Asn-X-Ser/Thr)Asn上 (2)O-糖基化:糖为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺,与Ser、Thr和Hyp的OH连接. O-连接糖基化在高尔基体进行.N-连接的糖基化 2）羟基化：在合成胶原蛋白时，Pro和Lys都需羟基化。 3）形成脂锚定蛋白：新合成的蛋白质除成为跨膜蛋白或可溶性蛋白外，有的还通过酰基化同ER上的糖脂结合，将自己锚在ER膜上。第三节:高尔基复合体(Golgi co
