食品类微生物实验

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1、菌样被菌样被无菌水无菌水不同稀不同稀释倍率释倍率后后平板平板培养图培养图实验1显微镜的使用 一、实验目的和内容 目的：学习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。 内容：1学习油浸系物镜的使用方法。 2用油镜观察枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。 二、实验材料和用具 枯草芽孢杆菌（Bacillus subitilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的染色装片。 香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。 三显微镜的构造与成像原理 （一）显微镜的构造包括机械部分和光学部分 1机械部分：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、移动

2、器、粗调器和细调器。 （1）镜座和镜臂它们是显微镜的基本骨架，起稳固和支持显微镜的作用。 （2）镜筒镜筒上接目镜，下接转换器，形成目镜与物镜（装在转换器下）间的暗室。 （3）物镜转换器物镜转换器上可安装34个物镜，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。 （4）载物台用于安放玻片。载物台中有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。 （5）推动器是移动标本的机械装置。 （6）调焦装置即粗螺旋和细螺旋，是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件。 2光学部分：目镜、物镜、聚光器、光圈、反光镜。

3、显微镜的光学系统 （l）反光镜由一平面和另一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央，照明标本。 （2）聚光器在载物台下面，它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到照明，使物象获得明亮清晰的效果。 （3）物镜 物镜的种类很多，可从不同角度来分类： 根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为： 干燥系物镜以空气为介质，如常用的40X以下的物镜，数值孔径均小于1。 油浸系物镜常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为90X100X，数值孔径值大于1。 根据物镜放大率的高低，可分为： 低倍物镜指l0X以下； 中倍物

4、镜指20X； 高倍物镜指40X65X； 油浸物镜指90X以上。 （4）目镜目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目透镜”，下端的透镜称“聚透镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”。 （二）显微镜的成像原理 显微镜的放大是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。由单透镜组合而成的透镜组相当于一个凸透镜，放大作用更好。 显微镜的结构光线在穿过折射率不同的介质时发生折射。 （三）显微镜的性能 显微镜分辨能力的高低决定于光学系统的各种条件。被观察的物体必须放大率高，而

5、且清晰，物体放大后，能否呈现清晰的细微结构，首先取决于物镜的性能，其次为目镜和聚光镜的性能。 油镜头的辨认 油镜头上常刻有OI（oilimmersion）或HI（homogeneneousimmersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，在低倍物镜、高倍物镜和油镜3物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numericalaperture）最大，而工作距离最短。 四、操作步骤 （一）观察前的准备 1放置：将显微镜置于平稳实验台上，镜座距实验台边沿约为10cm。坐正，练习用左眼观察。 2调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。转动反光镜采集光源，光线

6、较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察未染色装片时，光线不宜太强。 （二）低倍镜观察染色装片 首先上升镜筒，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升（或使镜台下降）至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。 （三）高倍镜观察 眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相撞。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调

7、节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。 （四）油镜观察 1提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位（镜头的正下方）滴一滴香柏油。 2从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。 3将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升（切忌反方向旋转），当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。 4再次观察提起镜筒，换上金黄色葡

8、萄球菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。 （五）镜检完毕后的工作 1移开物镜镜头。 2取出装片。 3清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。 4擦净显微镜，将各部分还原。将接物镜呈“八”字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。 四、注意事项 1使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察 2下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，

9、以免压碎玻片而损坏镜头。 3使用二甲苯擦镜头时，注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。 4注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。实验2细菌的染色与观察一目的要求1了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。2初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。3观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征。学会初步鉴别微生物的种类的方法。二实验内容与原理1简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。由于细

10、菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。简单染色过程：涂片固定染色水洗干燥镜检2革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生HansChristianGram于1884年创立。它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁结构的比较革兰氏染色过程：涂片固定结晶紫初染（1min）碘液媒染（1min）乙醇脱色（95

11、%酒精，30s）番红复染（30秒）干燥镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：1）初染：用结晶紫，染色1分钟，水洗。2）媒染：加碘液覆盖1分钟后水洗。3）脱色：连续滴加95乙醇，约30秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。（关键）4）复染：加番红染色1分钟，水洗。5）干燥。6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。 3芽孢染色原理 细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可

12、明显区分芽孢和营养体结构。 操作方法： 1）用枯草杆菌涂片、干燥、固定。 2）在涂菌处滴加5的孔雀绿染液，用木夹夹住玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但不沸腾56分钟。加热时应添加染料，以免蒸干。水洗。 3）番红复染1分钟，水洗，烘干，镜检（芽孢绿色，菌体红色）。 4荚膜染色原理 荚膜与染料亲和力低。在用简单染色法时，可以辨认出来。而通过荚膜染色也可以把它和细胞区别开来。 操作方法： 1）涂片，晾干。 2）用Tyier氏醋酸结晶紫溶液染色2分钟，再用20%硫酸铜溶液洗涤，水洗，用滤纸吸干、干燥。 3）镜检：荚膜染成浅红色，细胞呈紫红色。 5鞭毛染色法原理 细菌鞭毛直径为1012nm，超过了光学显微

13、镜的分辨能力。所以染色时，不仅要使鞭毛染色，还要使一部分染料堆积在鞭毛上，加粗鞭毛的直径以便能观察。鞭毛染色的方法很多，但染色成功的关键一是必须使用新鲜培养、活动活泼的菌体进行染色；二是使用绝对无油的干净玻片，以便菌液流过玻片时能保持自然形态。细菌的运动性，可通过悬滴法制片观察。注意区分布朗运动和细菌本身的运动。 操作方法： 1）载片的制备：经过严格清洗后，置于95%乙醇中浸泡，用时才取出，用火焰烧去酒精，立即使用。 2）菌种的制备：取已活化35代的变形杆菌（或枯草杆菌）接种于新制备的肉汤琼脂斜面，斜面下部最好有冷凝水，培养89h即可使用。 3）制片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，挑取少许菌苔底

14、部有水部分的菌体，将接种环悬放在水滴中片刻，再将载片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，放平，晾干。 4）染色：滴加鞭毛染色液A，35分钟，小心水洗干净，然后滴加鞭毛染色液B，3060秒，水洗，晾干。 A液：a.5%石炭酸10mlb.鞣酸2gc.饱和硫酸钾铝10mlB液：结晶紫酒精饱和溶液。应用液：A液10份，B液1份，混合过滤后室温存放。试剂配制说明：A液：又称媒染剂，其中的石炭酸又名苯酚，配制5%石炭酸：将5g石炭酸溶于100ml蒸馏水中，加温有助于试剂溶解。鞣酸又名单宁酸，具有沉淀蛋白质的作用，在媒染过程中起到重要作用。配制饱和硫酸钾铝：将25g明矾溶于100ml蒸馏水中，加温有助于明矾

15、的溶解。a、b、c三种试剂混合后需加温，有助于其中的鞣酸溶解。B液：又称染色剂，饱和结晶紫酒精溶液的配制：12g结晶紫溶于100ml无水乙醇中。应用液的A液和B液混合后需加热溶解，因鞣酸为胶状物，常温下不易溶解。A染液和B染液混合后需用0.2M的滤膜或较厚的过滤纸过滤，放置12天后染色的效果较好。 5）镜检：菌体、鞭毛均为褐色。 悬滴法： 1）在盖玻片上滴小半滴无菌水。 2）以无菌操作挑菌，接种环在水上轻点几下。 3）将盖玻片迅速翻转置于凹玻片上即可观察。 6.菌落特征的观察 注意细菌落形状、大小、颜色、光泽、透明度、干燥或湿润、粘稠度、隆起情况、边缘状况等。实验3酵母菌的形态观察 一目的要求

16、 1.观察酵母菌的个体形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。 2.掌握酵母菌的菌落特征及其与细菌菌落的区别。 二实验原理 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，多数是圆形或椭圆形，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。用美蓝对酵母菌的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。 三实验材料 （1）菌种：啤酒酵母、面包酵母、裂殖酵母、热带假丝酵母。 （2）0.1%的美蓝染色液，芽孢染色液、无菌水、盖玻片、载玻片。 四内容与步骤 1菌落特征和菌苔特征的观察。观察菌落表面干燥或湿润、隆起形状、边缘整齐度、大小、颜色等，并用接种环挑菌，注意与培养基结合是否紧密。取斜面培养的啤酒酵母、面包酵母、热带假丝酵母观察菌苔特征。 2个体形态与出芽生殖：采用水浸片法。即在载玻片上加一滴0.1%美蓝染液（或一滴蒸馏水），挑取少许啤酒酵母与染液混匀，将盖片斜置，慢慢放下，以免产生气泡，用滤纸片吸取多余是水