第5章同位素分析技术教学讲义

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1、第第5 5章章 同位素分析技术同位素分析技术中国农业大学 齐孟文 第第5 5章章 同位素分析技术同位素分析技术 5.5.同位素稀释分析方法同位素稀释分析方法(Isotope dilution (Isotope dilution analysis,ID) analysis,ID) 1.1.直接稀释法直接稀释法 由稀释前后总活度不变由稀释前后总活度不变, ,有有: : 只需部分分离,测定只需部分分离,测定 S Sm m。 例题例题 测定测定152.6mg152.6mg蛋百质水解液中甘氨酸的含量蛋百质水解液中甘氨酸的含量。为此,将比活度为。为此,将比活度为96.2cpm/mg96.2cpm/mg的的

2、5.07mg5.07mg1414C-C-甘甘氨酸加到水解液,混均后分离出部分纯的甘氨氨酸加到水解液,混均后分离出部分纯的甘氨酸,测得其比活度酸,测得其比活度51.3cpm/mg51.3cpm/mg。 则则 例题例题 测定小球藻测定小球藻1414COCO2 2光合作用生成的光合作用生成的1414C-C-蛋白质中蛋白质中谷氨酸的含量。为此,取适量谷氨酸的含量。为此,取适量1414C-C-蛋白质水解,从蛋白质水解,从中分离出部分纯的谷氨酸,测得其比活度为中分离出部分纯的谷氨酸,测得其比活度为254dpm/mg.254dpm/mg.在同样试样的水解液中,加入在同样试样的水解液中,加入10.7mg10.

3、7mg非非标记谷氨酸,混合均匀后,分离出部分纯的谷氨酸标记谷氨酸,混合均匀后,分离出部分纯的谷氨酸,测得其比活度为,测得其比活度为191dpm/mg191dpm/mg。 则则 3.3.亚化学计量稀释法亚化学计量稀释法(substiochiometry (substiochiometry istope dilution analysis) istope dilution analysis) 从稀释系统和示踪剂原液分离出等量的化合从稀释系统和示踪剂原液分离出等量的化合物,同时测量,则因物,同时测量,则因 有:有: 等量分离可利用,难溶化合物的溶解度一定,等量分离可利用,难溶化合物的溶解度一定,一定

4、电量下电解质的析出量一定,吸附剂的饱和吸一定电量下电解质的析出量一定,吸附剂的饱和吸附量一定,不足萃取剂的饱和萃取量一定等性质。附量一定,不足萃取剂的饱和萃取量一定等性质。 4. 4.改进的亚化学剂量法改进的亚化学剂量法(improved (improved substiochiometry istope dilution analysis)substiochiometry istope dilution analysis) 1 1)定量示踪法)定量示踪法 在分析样品时,同时取含待测物已知的标样,在分析样品时,同时取含待测物已知的标样,分别加入等量的标记物,则:分别加入等量的标记物,则:若若

5、则则 若用亚化学剂量法分离出等量待测物,若用亚化学剂量法分离出等量待测物, 则则 该法不必知道所加入标记物的量该法不必知道所加入标记物的量ww0 0,从而,从而避免由其因质量小不易准确测量产生的误差。避免由其因质量小不易准确测量产生的误差。 2)2)平行稀释法平行稀释法 该法与上法类似,但当标记物的加入量不能该法与上法类似,但当标记物的加入量不能忽略时,分析时,可取两份等量样品忽略时,分析时,可取两份等量样品wwx x,分别,分别加入不同量的标准待测物加入不同量的标准待测物ww1 1和和ww2 2,然后再加等,然后再加等量标记物,此时其量可忽略,因此:量标记物,此时其量可忽略,因此: 若采用亚

6、化学计量法分离,使若采用亚化学计量法分离,使 , 有有 则则 5. 5. 在现代仪器尤其是质谱分析中,同位素在现代仪器尤其是质谱分析中,同位素稀释法常作为一种内标计量分析的手段。稀释法常作为一种内标计量分析的手段。 举例举例 Max haldimann et al. Direct determination of yrinary iodine by Max haldimann et al. Direct determination of yrinary iodine by inductively coupled plasma mass spectrometry using isotope di

7、lution whih inductively coupled plasma mass spectrometry using isotope dilution whih iodine-129.Clinical chemistry1998;44(4):817-824iodine-129.Clinical chemistry1998;44(4):817-824 碘是合成人体甲状腺激素所必需微量营养元素碘是合成人体甲状腺激素所必需微量营养元素,甲状腺激素在为维持机体能量代谢,促进人体骨,甲状腺激素在为维持机体能量代谢,促进人体骨骼发育,脑发育和垂体的支持作用中具有重要的生骼发育,脑发育和垂体的支持作

8、用中具有重要的生理作用,在碘缺乏地区,推行加碘盐是预防碘缺乏理作用,在碘缺乏地区,推行加碘盐是预防碘缺乏疾病的国家行动,测定尿碘的浓度是指导补碘的基疾病的国家行动,测定尿碘的浓度是指导补碘的基本依据,而本依据,而129I I同位素稀释同位素稀释ICPICPMSMS是一种最准是一种最准确的测定尿碘的方法。确的测定尿碘的方法。 理论:理论: 碘是单同位素元素,核素为碘是单同位素元素,核素为127127I I,为此只能,为此只能以其长寿命的放射性同位素以其长寿命的放射性同位素129129I I作为内标。样品作为内标。样品添加内标后,混合物中碘同位素核素的原子个添加内标后,混合物中碘同位素核素的原子个

9、数比,相应于数比,相应于ICP-MSICP-MS测定的测定的129129I I与与127127I I的强度比的强度比值值R R,即,即 式中,式中,n n为碘的摩尔数,为碘的摩尔数,a a为碘的同位素为碘的同位素127127或或129129的丰度,下角标的丰度,下角标s s和和u u分别代表内标和尿样。分别代表内标和尿样。 重排上式,并假设重排上式,并假设 ,则尿样中未知,则尿样中未知 碘的摩尔数为碘的摩尔数为 考虑到质谱过程可能发生同位素质量歧视效应考虑到质谱过程可能发生同位素质量歧视效应,使得测定的,使得测定的R R值带有系统偏差,应引入一系统校值带有系统偏差,应引入一系统校正因子正因子f

10、, f,该因子可由对确切知道同位素构成的标样该因子可由对确切知道同位素构成的标样测定而确定,即测定而确定,即 式中,式中,R Rtruetrue是标准中确切已知的同位素比值,而是标准中确切已知的同位素比值,而 R Rexpexp是质谱实际测定的同位素比值。是质谱实际测定的同位素比值。 最终,用最终,用ICP-MSICP-MS测定尿碘的同位素稀释计量关系测定尿碘的同位素稀释计量关系式为式为 5.2 5.2 体外放射分析体外放射分析(in vitiro (in vitiro radioassay)radioassay) 在体外条件下,以放射性标记的配体为示踪剂在体外条件下,以放射性标记的配体为示踪

11、剂,以竞争或非竞争性免疫结合为基础,以放射性检,以竞争或非竞争性免疫结合为基础,以放射性检测为定量手段的超微量物质分析技术。测为定量手段的超微量物质分析技术。 竞争竞争 放射免疫分析放射免疫分析 抗体抗体-抗源抗源 非竞争非竞争 免疫放射分析免疫放射分析类型类型 结合蛋白结合蛋白-激素激素 竞争性结合蛋分析竞争性结合蛋分析 受体受体- - 配体配体 竞争性受体竞争性受体- -体配体分析体配体分析 1.1.放射免疫分析放射免疫分析(Radioimmunoassy,RIA)(Radioimmunoassy,RIA) oo 建立在待测抗原物质对标记抗原与限量特异建立在待测抗原物质对标记抗原与限量特异

12、性抗体的结合竞争抑制基础上的将免疫学反应高性抗体的结合竞争抑制基础上的将免疫学反应高度特异性与放射性测量高度灵敏性相结合的一种度特异性与放射性测量高度灵敏性相结合的一种超微量分析方法。超微量分析方法。oo 特点:灵敏度高特点:灵敏度高(10(10-9 -9 1010-12-12g)g),特异性强,特异性强,重现性好,抗体可用免疫学方法根据需要制备。重现性好,抗体可用免疫学方法根据需要制备。 1)1)基本概念基本概念 抗原抗原(Antigen,Ag)(Antigen,Ag) 能刺激动物的免疫系统产生能刺激动物的免疫系统产生抗体抗体( (免疫原性免疫原性) ) ,并与所产生的抗体能特异性,并与所产

13、生的抗体能特异性结合结合( (反应原性反应原性) )的物质。的物质。 抗原决定簇(抗原决定簇(Antigenic determinant)Antigenic determinant) 在抗原在抗原分子表面决定抗源与抗体特异性作用的特殊基分子表面决定抗源与抗体特异性作用的特殊基团,又称为表位团,又称为表位(epitope)(epitope)。 半抗原半抗原 (hapten)(hapten) 具有反应原性而不具有免疫原具有反应原性而不具有免疫原性的小分子物质。性的小分子物质。 人工抗原人工抗原(Artificial antigen) (Artificial antigen) 把半抗原与载把半抗原与

14、载体蛋白分子体蛋白分子( (人、牛血清蛋白人、牛血清蛋白) )共键结合形成的共键结合形成的抗原物质。抗原物质。 标记抗原标记抗原(Labelled antigen) (Labelled antigen) 被放射性核素标被放射性核素标记的抗原。记的抗原。 抗体抗体(Antibody,Ab)(Antibody,Ab) 由抗原刺激动物机体产生的由抗原刺激动物机体产生的免疫球蛋白,存在于血清中,所以常又称为抗免疫球蛋白,存在于血清中,所以常又称为抗血清,能与相应的抗原特异性结合。血清,能与相应的抗原特异性结合。 2)2)基本反原理基本反原理 * *Ag+Ab Ag+Ab *Ag*Ag. .AbAb F

15、 F + + BB Ag Ag Ag Ag . . Ab Ab AgAg(应变量)与(应变量)与* *Ag Ag . .AbAb(自变量)间存在着逆(自变量)间存在着逆函数关系,可予以定量。函数关系,可予以定量。K1 K2定量关系演释定量关系演释Ag Ag *Ag*Ag AbAb Bound Free B F B/F Bound Free B F B/F0.670.3310.500.5020.50.330.670.20.170.83竞争放射分析原理示意图 3 3)基本试剂)基本试剂 标准抗原标准抗原 用于测定反应剂量曲线或制备标记抗原,纯用于测定反应剂量曲线或制备标记抗原,纯 度应度应90%9

16、0%。 标记抗原标记抗原 多肽类抗原常用碘标多肽类抗原常用碘标 原理原理 用氧化剂如氯胺用氧化剂如氯胺T T使使 I I*-*- 氧化成氧化成 I I* *,然后去取,然后去取代肽分子中酪氨酸残基苯环上的氢原子。代肽分子中酪氨酸残基苯环上的氢原子。 抗体抗体免疫制备途径:免疫制备途径:1 1)人工抗原的制备)人工抗原的制备oo 具有重要生物意义的小分子半抗原具有重要生物意义的小分子半抗原 l l 植物激素植物激素l l 生物活性物质生物活性物质l l 药物药物( (农药农药) )半抗原半抗原+ +蛋白质载体蛋白质载体(HSA(HSA,BSA) BSA) 蛋白蛋白 半抗原半抗原 oo 偶联剂偶联剂l l 激活羧基激活羧基( (半抗原上半抗原上) )使之与氨基使之与氨基( (蛋白上蛋白上) )缩合缩合生成生成 (CO(CO NH)NH) 。l l 在氨基间搭桥。在氨基间搭桥。l l 能在酪氨酰,组氨酰或赖氨酰残基间搭桥的双能在酪氨酰,组氨酰或赖氨酰残基间搭桥的双功能重氮盐。功能重氮盐。 碳二亚胺法碳二亚胺法 混合酸酐法混合酸酐法 戊二醛法戊二醛法 琥珀酸酐法琥珀酸酐法 重氮化的对氨基苯甲酸

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