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1、8 真核基因表达调控l真核生物基因调控主要包括：l瞬时调控或称可逆性调控；l发育调控又称不可逆调控,是真核基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。图8-1真核基因表达调控的主要步骤示意图*调控步骤8.1真核生物的基因结构与转录活性l在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，很少原核生物中常见的多基因操纵子形式。l 真核细胞DNA与组蛋自和大量非组蛋白结合，只有一小部分DNA是裸露的。l高等真核细胞DNA中很大一部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。l真核生物的RNA在细胞核中合成只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质
2、。l许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程，才能被顺利地翻译成蛋白质。8.1.1基因家族（gene family）l真核细胞中许多相关的基因常按功能成套组合，被称为基因家族。l同一家族中的成员有时紧密地排列在一起，成为一个基因簇，也可能分散在同一染色体的不同部位，甚至位于不同的染色体上，具有各自不同的表达调控模式。l1、简单多基因家族：一般以串联方式前后相连。l2、复杂多基因家族：复杂多基因家族一般由几个相关基因家族构成，基因家族之间由间隔序列隔开，并作为独立的转录单位。l3、发育调控的复杂多基因家族：8.1.2真核基因的断裂结构l1、外显子与内含子l“intron”是指存在于原始转录
3、物或基因组DNA中，但不存在于成熟mRNA、rRNA或tRNA中的那部分核苷酸序列。大多数真核基因都是由蛋白质编码序列和非蛋白质编码序列两部分组成的。l编码序列称为外显子（exon），非编码序列称为内含子（intron）l2、外显子与内含子的连接区。l断裂结构的一个重要特点是外显子-内含子连接区（exonintronjunction）的高度保守性和特异性碱基序列。l序列分析表明，几乎每个内含子5端起始的两个碱基都是GT，而3端最后两个碱基总是AG，由于这两个碱基的高度保守性和广泛性，有人把它称为GT-AG法则，即：5GTAG 3。l3、外显子与内含子的可变调控l真核基因的原始转录产物可通过不同
4、的剪接产生不同的mRNA，翻译成不同的蛋白质。l有些真核基因，能精确地剪接成一个成熟的mRNA，我们称这种方式为组成型剪接。一个基因的转录产物通过组成型剪接只能产生一种成熟的mRNA，编码一个多肽。l同一基因的转录产物由于不同的剪接方式形成不同mRNA的过程称为选择性剪接。l一个基因的内含子成为另一个基因的外显子，形成基因的差别表达，这是真核基因的一个重要特点。8.1.3真核生物DNA水平上的基因表达调控DNA水平的调控是真核生物发育调控的一种形式，包括基因丢失、扩增、重排和移位等。l1.“开放”型活性染色质结构对转录的影响l2.基因扩增：是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象l3.基因重排
5、与变换：将一个基因从远离启动子的地方移到较近的位点从而启动转录，被称为基因重排。8.1.4 DNA甲基化与基因调控lDNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。lDNA甲基化能关闭某些基因的活性、去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。1DNA的甲基化 DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。 在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和GATC中。因为高等生物CpG二核苷酸序列中的C 通常是甲基化的，极易自发脱氨，生成胸腺嘧
6、啶。 由于这些CpG二核苷酸通常成串出现在DNA上，这段序列往往被称为CpG岛。2.DNA甲基化抑制基因转录的机制lDNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。l对于弱启动子来说，稀少的甲基化就能使其完全失去转录活性。当这一类启动子被增强时（带有增强子），即使不去甲基化也可以恢复其转录活性。若进一步提高甲基化密度，即使增强后的启动子仍无转录活性。图8-14 DNA甲基化对基因转录的抑制作用箭头粗细表示转录活性强弱，空心圆表示DNA未甲基化，小黑点表示DNA甲基化，椭圆形表示MeCPl松散结合，长方形表示MeCPI紧密结合。
7、甲基化对转录的抑制强度与MeCPl（methyl CpG-binding protein l）结合DNA的能力成正相关，甲基化CpG的密度和启动子强度之间的平衡决定了该启动子是否具有转录活性。 3DNA甲基化与X染色体失活lX染色体失活是发育过程中独特的调节机制。l 雌性胎生哺乳类动物细胞中两条X染色体之一在发育早期随机失活，以确保与只有一条X染色体的雄性个体内X染色体基因的剂量相同。一旦发生X染色体失活，这个信息便能够稳定地传递给子代细胞，使该细胞有丝分裂所产生的后代都保持同一条X染色体失活。8. 2 真核基因转录机器的主要组成l真核基因调控主要在转录水平上进行，受大量特定的顺式作用元件（c
8、is-acting element）和反式作用因子（transacting factor，又称跨域作用因子）调控。真核生物的转录调控是整个基因表达调控的关键点之一l顺式作用元件： 由若干可以区分的DNA序列组成，并与特定的功能基因相连，组成基因转录的调控区，通过与相应的反式作用因子结合，实现对基因转录的调控。l反式作用因子： 能直接地或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白因子，也被称为转录因子（TF）。8.2.1 真核基因的转录l“基因”的分子生物学定义是：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。图8-16 真核基因的一般构造示意图1、启动子（p
9、romoter）l存在于结构基因上游，与基因转录启动有关的一段特殊的DNA序列。l真核基因启动子由核心启动子和上游启动子两个部分组成，是在基因转录起始位点（+1）及其5上游大约100200bp以内的一组具有独立功能的DNA序列，每个元件长度约为720bp，是决定RNA聚合酶II转录起始点和转录频率的关键元件。l核心启动子（core promoter）：是指保证RNA聚合酶II转录正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游-25-30bp处的TATA盒。核心启动子确定转录起始位点并产生基础水平的转录。l上游启动子元件（upstream promoter element
10、，UPE）包括通常位于-70bp附近的CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等，能通过TFIID复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。2.转录模板l包括从转录起始位点到RNA聚合酶II转录终止处的全部DNA序列3.RNA聚合酶IIl至少由1012个亚基组成，其中最大亚基的羧基端含有7个氨基酸残基组成的羧基端结构域（CTD）4.RNA聚合酶II基础转录所需的蛋白质因子（以TFII表示）l包括TFIID、 TFIIB、 TFIIF、 TFIIE、 TFIIH、 TFIIA等8.2.2 增强子及其对转录的影响l增强子是指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列，最早发现于SV40早
11、期基因的上游，有两个长72bp的正向重复序列。增强子通常具有下列特性：lA、增强效应十分明显。lB、增强效应与其位置和取向无关。lC、大多为重复序列（50bp）。lD、其增强效应有严密的组织和细胞特异性。lE、没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应；lF、许多增强子还受外部信号的调控。 增强子可能有如下增强子可能有如下3 3种作用机制种作用机制影响模板附近的影响模板附近的DNADNA双螺旋结双螺旋结构，导致构，导致DNADNA双螺旋弯折或在反双螺旋弯折或在反式因子的参与下，以蛋白质之式因子的参与下，以蛋白质之间的相互作用为媒介形成增强间的相互作用为媒介形成增强子与启动子之间子与启动
12、子之间“成环成环”连接连接，活化基因转录；，活化基因转录；将模板固定在细胞核内特定将模板固定在细胞核内特定位置，如连接在核基质上，有位置，如连接在核基质上，有利于利于DNADNA拓扑异构酶改变拓扑异构酶改变DNADNA双双螺旋结构的张力，促进螺旋结构的张力，促进RNARNA聚合聚合酶酶IIII在在DNADNA链上的结合和滑动；链上的结合和滑动；增强子区可以作为反式作用增强子区可以作为反式作用因子或因子或RNARNA聚合酶聚合酶IIII进入染色质进入染色质结构的结构的“入口入口”。增强子的作用原理是什么呢？8.2. 3 反式作用因子l根据各个蛋白质成分在转录中的作用，能将整个复合物分为3部分：l
13、参与所有或某些转录阶段的RNA聚合酶亚基，不具有基因特异性。l与转录的起始或终止有关的辅助因子，不具有基因特异性。l与特异调控序列结合的转录因子。1. DNA识别或结合域l反式作用因子是能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。A、螺旋-转折-螺旋（helix-turn-helix, H-T-H）结构l这一类蛋白质分子中有至少两个螺旋，中间由短侧连氨基酸残基形成“转折”，近羧基端的螺旋中氨基酸残基的替换会影响该蛋白质在DNA双螺旋大沟中的结合。图8-18同源域蛋白通过其第三个螺旋与双链DNA的大沟相结合，其N端的多余臂部分则与DNA的小沟相结合，提高
14、了稳定性。B、锌指（Zinc finger）蛋白：l包括锌指、锌钮(twist)和锌簇(cluster)结构，有锌参与时才具备转录调控活性。与DNA的结合较为牢固，特异性也很高。l类固醇激素受体家族含有连续的两个锌指结构，以同源或异源性二聚体的方式将两个螺旋结合在相邻的两个大沟中。锌指由重复的半胱氨酸和组氨酸或重复的半胱氨酸在一个金属锌离子四周形成一个四面体的排列。长约30个aa，其中4个氨基酸（4个Cys或2个Cys，2个His）与一个Zinc原子相结合。与Zinc结合后锌指结构较稳定。 图8-19典型的类固醇激素受体结构示意图l具有Cys- X2- Cys-X13Cys- X2- Cys样
15、的保守序列，Zn2+与4个Cys结合称为Cys2/Cys2锌指，这些蛋白一般无大量重复性锌指，其DNA结合序列较短且对称。这种结构域常出现在类固醇激素受体蛋白，酵母的GAL4转录因子也具有一个这样的锌指结构。Cys2/Cys2锌指与Cys2/His2锌指结构不同，Cys与His是不能互换的。表8-6一些转录因子和蛋白质通过Cys2/His2与DNA相结合表8-7具有Cys2/Cys2锌指区的转录因子C、碱性-亮氨酸拉链（basic-leucine zipper）l即bZIP结构。蛋白中每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，导致第7个亮氨酸残基都在螺旋的同一方向出现。l以二聚体形式与DNA结合，亮氨
16、酸拉链区并不直接结合DNA，肽链氨基端2030个富含碱性氨基酸结构域与DNA结合，但以碱性区和亮氨酸拉链结构域整体作为基础。图8-20碱性亮氨酸拉链结构域转录激活因子。图8-21碱性亮氨酸拉链转录激活蛋白与调控区DNA相结合的示意图D、碱性-螺旋-环-螺旋（basichelix/loop/helix，）l即bHLH结构，在免疫球蛋白轻链基因的增强子结合蛋白E12与E47中，羧基端100200个氨基酸残基可形成两个两性螺旋，被非螺旋的环状结构所隔开，蛋白质的氨基端则是碱性区，其DNA结合特性与亮氨酸拉链类蛋白相似。lbHLH类蛋白只有形成同源或异源二聚体时，才具有足够的DNA结合能力。当这类异源二聚体中的一方不含有碱性区（如Id或E12蛋白）时，该二聚体明显缺乏对靶DNA的亲和力。图8-22 bHLH蛋白的DNA结合能力分析E、同源域（homeo domains)l是指编码60个保守氨基酸序列的DNA片段，它广泛存在于真核生物基因组内，由于最早从果蝇homeotic loci（该遗传位点的基因产物决定了躯体发育）中克隆得到而命名，同源转换基因与生物有机体的生长、发育和分化密切相关。螺旋转
