课题课题2 2土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数专题专题2 2微生物的培养与应用微生物的培养与应用一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥农业氮肥尿素尿素不能直接不能直接被农被农作物作物吸收土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才之后才能被植物利用能被植物利用2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2) )脲酶脲酶+ H+ H2 2OO+ CO+ CO2 2NHNH3 33 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素也能分解尿素4 4、课题目的、课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一一. .研究思路研究思路. .筛选菌株筛选菌株. .统计菌落数目统计菌落数目. .设置对照设置对照要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；包括营养、生理、生长条件等；方法：方法：抑制大多数微生物不能生长抑制大多数微生物不能生长造成有利于该菌生长的环境，造成有利于该菌生长的环境，结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。
平板稀释等方法对它进行纯化培养分离2 2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件( (包括营包括营养、温度、养、温度、pHpH等等) )，同时抑制或阻止其他微生，同时抑制或阻止其他微生物生长15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微生物的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源才能分解尿素，以尿素作为氮源缺乏缺乏脲酶的微脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
择出分解尿素的微生物5 5、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量样品中微生物的数量 .统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞常用方法：稀释涂布平板法常用方法：稀释涂布平板法每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。
代表稀释倍数注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数的平板上进行计数为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出菌落平均数菌落平均数统计的菌落往往比活菌的实际数目低统计的菌落往往比活菌的实际数目低涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在落数在5050个左右为最好个左右为最好计数法计数法直接计数法、直接计数法、平板计数法、平板计数法、比浊法、比浊法、膜过滤法膜过滤法例题：统计菌落数目的方法有例题：统计菌落数目的方法有 （ ）A. B. A. B. C. D.C. D.DD涂布平板法涂布平板法 重量法重量法 直接计数法直接计数法 比浊法比浊法 生理指标法生理指标法 膜过滤法膜过滤法设置对照的主要目的设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 .设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6倍稀释的培养基倍稀释的培养基中筛选出大约中筛选出大约150150个菌落，但是其他同学在同样个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约的稀释度下只选择出大约5050个菌落分析其原因个菌落分析其原因原因：原因：土样不同，土样不同，培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误( (或或者是混入了其他的含氮物质者是混入了其他的含氮物质) )小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的说服力，对照的设置是必不可少的方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染否受到污染结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误无误；如果结果不同，则证明；如果结果不同，则证明A A同学存在操作失误或培同学存在操作失误或培养基的配制有问题。
养基的配制有问题二二. .实验的具体操作实验的具体操作 . .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌 .制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于计之间、适于计数的平板数的平板 三三 样品样品的稀释的稀释为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原因：原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg/kg）是不同的例如在干旱土壤中的上层样本中）是不同的例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 2 185185万，放线菌万，放线菌数约为数约为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。
万结论：结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件提供选择培养的条件 .取样涂布取样涂布实验时要对培养皿作好标记注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030030300的平板的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确试验不精确，需要重新实验需要重新实验 .微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目统计一次菌落数目选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目 培养不同微生物往往需要不同培养温度培养不同微生物往往需要不同培养温度细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。
微生物的培养微生物的培养与观察与观察三三. .结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物分解尿素的微生物2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030030300个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确四、操作提示四、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 五五. .课外延伸课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养某种细菌后，如果酚红指示剂培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素分解尿素测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝 培养培养基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述得出，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。
水样中大肠杆菌的数量大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 , ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊大肠杆菌在伊红美蓝琼脂红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结: :六、例题解析 例1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是A在液体培养基上进行 B至少接种一种细菌 C接种一个细菌 D及时补充消耗的营养物质 解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时。