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1、工程菌的高效表达和稳定性工程菌简简介 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细类细 胞株系一般称为为“工程菌”。 工程菌的高效表达基因工程的最终终目的是在一个合适的系统统中，使外源基因高效表达，从而生产产有价值值的蛋白质产质产 品。表达系统统有原核系统统和真核系统统。（4）原核基因不含内含子（intron），没有转录转录后加工过过程。（5）原核生物基因表达的控制主要是在转录转录 水平。对对RNA合成的调调控有两种方式：启始控制（启动动子控制）和终终止控制（衰减子控制）。（6）在大肠肠杆菌mRNA的核糖体结结合位点上，有一个转译转译 启始密码码子及同16S核糖体RNA3末端碱基互补补的序
2、列，即SD序列，真核基因则则无此序列。外源基因在原核中表达的关键键：（1）通过过表达载载体将外源基因导导入宿主菌，并指导导宿主菌的酶系统统合成外源蛋白；（2）外源基因不能带带有intron；（3）利用原核细细胞的强启动动子和SD序列等控制外源基因的表达；（4）外援基因与表达载载体连连接后，必须须形成正确的开放阅读阅读 框架；（5）利用宿主菌的调调控系统统，调节调节 外源基因的表达，防止表达的外源基因产产物对对宿主菌的毒害。外源基因在真核细细胞中的表达哺乳动动物细细胞做宿主表达体系的优优点：（1）能识别识别 和除去外源基因中的内含子，剪切加工成成熟的mRNA；（2）表达的蛋白质质在翻译译后被加工
3、的机会多（如糖基化），更接近于体内构型；（3）易被重组组DNA转转染，具有遗传稳遗传稳 定性和可重复性；（4）经转经转 化的哺乳动动物细细胞可将表达的产产物分泌到培养基中，提纯纯工艺简单艺简单 ，成本低。影响工程菌发酵的原因对发对发 酵影响较较大的几个因素有：培养基的影响；接种量的影响；温度的影响；溶解氧的影响；诱导时诱导时 机的影响；诱导诱导 表达程序的影响；pH的影响。1.培养基的影响培养基的组组成既要提高工程菌的生长长速率，又要保持工程菌的稳稳定性，从而使外源基因高效表达。2.接种量的影响接种量的大小影响发发酵的产产量和发发酵周期。接种量小，菌体延迟迟期较长较长 ，使菌龄龄老化，不利于外
4、源基因表达；接种量大，可缩缩短生长长延迟迟期，菌体迅速繁衍，很快进进入对对数生长长期，适于表达外源基因；接种量过过高，使菌体生长过长过快，代谢谢物积积累过过多，反而会抑制后期菌体的生长长。3.温度的影响温度对发对发 酵过过程的影响是多方面的。它影响各种酶的反应应速度，改变变菌体代谢产谢产 物的反应应方向，影响代谢调谢调 控机制。适宜的发发酵温度是既适合菌体的生长长，又适合代谢产谢产 物合成的温度。高温或低温都会使发发酵异常，影响终产终产 物的形成并导导致减产产。温度还还影响蛋白质质的活性和包含体的形成。4.溶解氧的影响对对于好氧发发酵,溶解氧浓浓度是重要的参数。好氧微生物利用溶解于培养液中的氧
5、气进进行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，则则能提高发发酵产产率。发发酵时时，随溶解氧浓浓度的下降，细细胞生长长减慢，发发酵后期下降幅度更大。外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细进细 胞的呼吸作用，提高对对氧的需求。维维持较较高的溶解氧值值，才能提高工程菌的生长长，利于外源蛋白产产物的形成。采用调节搅调节搅 拌转转速的方法,可改变变培养过过程中的氧供给给，提高活菌产产量。5. pH的影响根据工程菌的生长长和代谢谢情况，对对pH进进行适当的调节调节 。如采取两段培养工艺艺，培养前期重点是优优化工程菌的生长长条件，培养后期重点是优优化外源蛋白的表达条件。6.诱导时诱导时 机的影响一般在对对数
6、生长长期或对对数生长长后期升温诱导诱导 表达。在对对数生长长期，细细胞快速繁殖，这时这时 菌体数目倍增，对营对营 养和氧需求量急增，营营养和氧成了菌群旺盛代谢谢的限制因素。 7.诱导诱导 表达程序的影响热诱导热诱导 的程序提高外源蛋白表达量。基因工程菌的不稳定性基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。质粒不稳定可分为：分裂不稳定结构不稳定分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变导致质粒不稳定的常见的三个因素：常见的三个因素：1.1.含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；
7、2.2.这两种菌比数率差异的大小这两种菌比数率差异的大小; ;3.3.插入的外源基因影响了质粒稳定区的结构。对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数：低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。质粒稳定性的分析方法样品不含抗性标记抗生素 平板培养基10-12h100个菌落含抗性标记抗生素平板培养基 10-12h统计生长菌落数重复三次,计算比值(稳定性stability)提高质粒稳定性的方法1.选择合适宿主菌宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等都会影响质粒
8、的稳定性。2.选择选择 合适的载载体改造、构建能稳定表达的质粒载体是构建工程菌的重要一环。针对不同的载体及不同的目的采取不同的策略。3.选择压选择压 力从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。4.分段控制培养 提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定。可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。5.控制培养条件 对于一个已经组建完成的工程菌来说，选择最适的培养条件是进行工业化生产的关键 步骤。 环境因
9、素对质粒稳定性的影响机制错综复杂，许多尚属未知。 在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率3个方面尤其重要。1）培养基的组组成培养基对克隆菌稳定性的影响培养基 克隆菌 F20-25 不稳定型PBB W3110trpAE1trpR tnaA 7% 结构性MM (RSF 2124-trp) 99% 结构性PBB W3110 trpAE1 trpRam27 12% 分配性MM (pSC101-trp) 48% 分配性2）培养温度 对对于温度敏感性质质粒，为为了控制在生长长前期其外源基因不表达，一般采用二阶阶段温度培养系统统，即在菌种生长阶长阶 段，采用较较低的培养温度，当菌体生长
10、长至适宜浓浓度和生长时长时 期时时，提高温度进进行诱导诱导 ，使外源基因表达。重组组工程菌的生长长和产产物合成时时的PH往往不同。3）菌体比生长速率比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，并可能与克隆菌本身和培养条件有关。例如:在酵母系统中，大则质粒pJDB248稳定性高。 如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的工程菌生长快，则重组质粒的丢失也不会导致非常严重的后果；调整这两种菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性。但很难达到。在某些情况下，可以利用分解代谢物效应控制菌的比生长速率，降低值，提高重组质粒的稳定性。比生长速率 比生长速率为表征微生物生长速率的一个参数,其大小为0.69
11、3除以倍增时间 td（菌体量倍增）。 推算过程：假定在任何时间 （t），微生物细胞数目的增长速率（dN/dt）正比于已经存在的总细 胞数目（N），则得：dN/dt=N。 经积 分得：lnNt-lnN0=t，对于一倍增时间 ，t=td , Nt=2N0的培养物：ln2N0-lnN0=td 。易得：=ln2/td 。 参数含义： 比生长速率，单位h-1 t时间 ，单位h N任何时间处 微生物细胞量 Nt开始培养t时间过 后生物细胞量 N0开始时微生物细胞量 td倍增时间 ，即为微生物细胞量变为原来的两倍所需的时间6.固定化 固定化技术术包括固定化酶技术术与固定化微生物技术术。固定化微生物技术术是用
12、化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间间区域,以提高微生物细细胞的浓浓度,使其保持较较高的生物活性并反复利用的方法。良好固定化细胞方法的条件：1）应该能够控制固定化细胞的大小和空隙度；2）原料易得、成本较低，方法简便、易行，载体对细胞是惰性的，固定过程温和，对细胞损伤轻；3）固定化细胞应具有稳定的网状结构，在所使用的pH值和温度下，不会被破坏；4）在反应器内长时间运转过程中，固定化细胞具有良好的机械稳定性和化学稳定性；5）固定化细胞应使底物、产物和其他代谢物能够自由扩散，因为产物和其他代谢产物常能抑制细胞的酶反应；6）单位体积的固定化细胞应拥有尽可能多的细胞。固定化细胞的制备方法常用的有吸附法、包埋法、共价结合法、交联法、多孔物质包络法、超过滤法等，其中包埋法最为普遍。
