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1、单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式1 1* *第四节 核酸的凝胶电泳Nucleic Acid Gel ElectrophoresisContent of Table 前 言一、 琼脂糖凝胶电泳二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳三、 脉冲场凝胶电泳前 言 核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段； 优点：（1）便于分离;（2）便于检测;（3）便于回收： 一、 琼脂糖凝胶电泳Agarose gel electrophoresis（一）凝胶的制备及电泳（二）DNA的迁移速率决定因素 1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比
2、； 2 琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快； 3 DNA的构象 一般同一分子：超螺旋环状线状切口环状。 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。 5 所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 6 琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖； 不同类型琼脂糖的性质 琼脂糖类型凝结温度/熔化温度/ 标准琼脂糖35389095不同厂家生产的不同商品其凝结温度和熔化温度有一定差异40428590 高强度琼脂糖34438595 修饰的低熔点/ 凝点琼脂糖253563653565 超低熔点8154045 低黏性低熔点
3、琼脂糖25307038853075不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围浓浓 度（%）标标 准(kb)高强度(kb)低熔点(kb)低黏度低溶点(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.1 7 电泳缓冲液 常用的有TAE、TPE及TBETAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较 都是常用电泳缓冲液。三者相比：1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；2）TBE和
4、TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。 （二） 凝胶载样缓冲液载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；2）使样品带有颜色便于简化上样过程；3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。6凝胶载样缓冲液类型6 缓冲液贮存温度I0.25%溴酚蓝40.25%二甲苯氰FF40% (m/
5、V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚蓝室温0.25%二甲苯氰FF15% Ficoll(Type400)水溶液III0.25%溴酚蓝40.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液IV0.25%溴酚蓝440% (m/V)蔗糖水溶液（三）琼脂糖凝胶中DNA的检测 通过染色, 紫外灯下检测。 主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和SYBR Gold染色法。1 凝胶的EB染色使用EB染色注意事项（1）EB被认为是一种强致癌物质（2）EB可用来检测单链或双链核酸 （3）EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度
6、为0.5 g/ml 。（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。2 凝胶SYBR Gold的染色 SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。（四） 凝胶中DNA的成像 可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。（五） 凝胶中DNA的回收现一般采用试剂盒回收： 存在的主要问题：1 不能有效的回收大片段DNA 2 不能有效回收少量DNA Home单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式2828* *二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylami
7、de gel electrophoresisPAGE 在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。 在双功能交联剂如N，N-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N-亚甲双丙烯酰胺） （二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。 变性的DNA在这些
8、凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的DNA片段。（三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围丙烯酰烯酰 胺浓浓度（%）有效分离范围围（bp）二甲苯氰氰FF溴酚蓝蓝3.5100020004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512注:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30; Home三、 脉冲场凝胶电泳pulsed-f
9、ield gel electrophoresis PFGE为何选PFGE？ 超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。但 PEGE 解决了这一问题。 （一） PFGE 工作的基本原理 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。 该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。B+A-+A-B脉冲电场电泳示意图（二）PEGE类型 垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field) 场翻转系
10、统(field inversion) 旋转胶系统(rotating gel) 箝位匀强电场系统(contour-clamped homogeneous electric field)A-+AB-+B垂直交变电场系统场翻转系统箝位匀强电场系统旋转胶系统A-+AB-+BA-+AB-+B-+（三） 影响分辨率的因素1 脉冲时间（0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。2 电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。3 电场夹角：电场方向的夹角常为1100 - 1200，研究证实900夹角也非常有效的。4 温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE一般应在4 进行。较高的温度DNA泳动较快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。Home
