头C发酵进展

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1、单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式*1头孢菌素C发酵相关进展 一.前言 二.发酵历史沿革 三.目前生产技术现状 四.技术前沿 五.我集团情况介绍及国内市场分析 一.前言 头孢类药物是抗生素类药物中最重要的药物之一，其市场份额已占到抗生素类药物物市场份额的一半以上。7-氨基头孢烷酸（7-ACA)作为合成头孢类药物的三大基本母核之一（7-ACA ，7-ADCA，GCLE），虽然全化学合成方法早已经成功，但由于成本原因，目前工业上7-ACA主要是由顶头孢霉菌产生的头孢菌素C经化学或酶法裂解生产的。 二.发酵历史沿革 1945年，意大利科学家首先发现了产生广谱抗菌活性物质的一株顶头孢霉

2、菌；1953年，从这一霉菌的发酵液中分离到化学结构不同于青霉素的第二类&-内酰胺抗生素-头孢菌素C，对金黄色葡萄球菌的抗菌活性，头C的抗菌活性只及青霉素N的1，青霉素N只及青霉素的10，由于其抗菌活性低，而未能直接用于临床。 二.发酵历史沿革最初的原始菌株产生头C的能力很低，效价只有十几个单位。为了得到生产能力更高的菌株，各国科学家对菌株进行了反复的诱变、筛选，使菌种的生产能力不断提高。顶头孢霉M8560是用于工业生产的原始亲株，全世界所有高产菌株差不多都是由它反复诱变、筛选得到的。目前，发酵单位最高水平已接近4万（全液效价）。 二.发酵历史沿革经长期的遗传改良，产生头C的顶头孢霉在平板上生长

3、的菌落呈现出以下特点：直径缩小（由1015mm缩至35mm）、隆起高了将近1/4、颜色变浅，生长速度变慢，生长周期延长至47天，另外随着生产能力的提高，菌株产生孢子能力有出现退化的趋势，从而不利于菌种的保存。 二.发酵历史沿革青霉素是是世界上第一个进行工业化生产的抗生素品种，目前青霉素发酵生产工艺已经比较完善，已经实现了计算机自动化控制。头C发酵生产工艺受青霉素发酵生产工艺影响比较大。如上世纪70年代，分批补料半连续发酵工艺在青霉素生产中研制成功并用于大生产。受此启发，上世纪90年代，分批补料半连续发酵工艺在头孢菌素C发酵生产中成功运用，单罐产量得到大幅度提高，一是表现在放罐效价的提高，二是表

4、现在放罐体积的增大。 二.发酵历史沿革 头C生物合成途径及一些调控机制已经阐明。蛋氨酸的诱导作用及诱导机制被发现并成功应用于工业生产。另外，也选育出了不需要添加蛋氨酸的高产菌株。三.目前生产技术现状 目前，国外的头C生产商主要是韩国、意大利、日本、印度的一些厂商，其中，韩国、意大利的发酵水平处于世界领先地位。我国的生产商主要有石家庄制药集团、哈尔滨制药集团、山东鲁抗、山西威奇达、浙江海正、福抗、健康元等，我们集团的生产规模相对来说还比较小。目前生产技术现状 自70年代以来，英国、日本、荷兰等国相继研发酶法7ACA生产工艺（指由头C到7-ACA的转化），目前国外已全部实现了酶法7ACA的工业生产

5、，国内的生产厂家也正逐步由化学裂解法向酶法生产7ACA改进。目前生产技术现状 目前，头C的发酵大致划分为两种类型：一种是低菌浓、短周期、低单位、高质量的发酵液、高收率的发酵类型；二是高菌浓、长周期、高单位、收率相对略低的发酵类型。国内厂家多采用前一种发酵类型，周期120140小时，一般为130小时左右，放罐菌浓4552，而国外大多数厂家，一般采用后一种类型，周期160180小时，放罐菌浓6065.目前生产技术现状 单罐规模向逐步增大的趋势发展，目前发酵罐单罐规模均在100方以上，一些新上的发酵罐的单罐体积一般在180200立方。国外罐压一般保持在1公斤左右，国内生产厂家一般将罐压保持在0.50

6、.7公斤。近几年，国内大部分厂家，正逐步加大搅拌功率、提高罐压，改善中后期溶氧状况，以期望得到更高的发酵单位，提高经济效益。目前生产技术现状 产能情况将在下一部分讨论。 四.技术前沿 1.菌种的选育 菌种是影响头C发酵水平的第一位因素，一直是人们研究的热点。筛选去磷酸盐调节突变菌株、去碳源调节突变菌株、去铵离子调节突变菌株、前体抗性突变菌株、自身所产的抗生素抗性突变菌株是目前人们研究的方向。目前，已经利用传统育种技术选育出了不需要添加蛋氨酸，能够直接代谢无机硫的头C生产菌，如能推向工业生产，将成为降低发酵成本的一大亮点。技术前沿 虽然诱变育种仍然是目前微生物发酵工业的重要育种手段，但它的盲目性

7、决定了其低效性，同时目前的菌种是由野生菌种经长期反复诱变筛选得到的，依靠传统的育种方法来大幅度提高生产菌种的生产能力已经变得越来越困难。技术前沿 基因重组技术目前达到了实际应用的水平。由于基因工程育种具有明确的目的性，因此在头C的生物合成途径已经阐明的基础上，利用基因工程构建基因工程菌，已成为未来菌种改造的主要研究方向。下图为头C的生物合成途径：技术前沿 目前，利用基因重组技术改良抗生素的生产菌主要在以下几个方向：（1）、提高限速酶活力，解除抗生素生物合成中的限速步骤，改变细胞内代谢流的方向，提高抗生素的产量；（2）、引入抗性基因，增加抗性基因拷贝数，提高产生菌自身耐受性；（3）、引入氧结合蛋

8、白来提高氧的利用率；（4）、增强正调控或解除负调控基因的阻遏作用；通过敲除或破坏次要组分的生物合成基因来消除或减少次要组分。技术前沿1-1.分析头C工业菌株发酵液，发现有青霉素N积累，表明合成途径中的下一步反应限制了这一中间体的转化。礼来公司与牛津大学合作构建了头C产生菌的工程菌，其中一个转化子增多了一个拷贝的扩环酶基因，结果工程菌的发酵液中扩环酶的活性增加、青霉素N的浓度减少、最终CPC的产量增加了15。这说明工程菌中已有效解除了头孢菌素C生物合成中的限速步骤，使青霉素N向脱乙酰氧头孢菌素C、脱乙酰头孢菌素C的转化反应不再成为限速瓶颈。技术前沿1-2.抗性基因常常和生物合成基因连锁在一起，抗

9、性基因必须首先进行转录，建立抗性后，生物合成基因的转录才开始进行。抗性基因不但通过它的产物灭活细胞内外的抗生素，保护自身免受所产生的抗生素的杀灭作用，有些抗性基因的产物还直接参与抗生素的合成。因此可以通过增加外源抗性基因的拷贝数来提高菌种的抗性水平，达到提高产量的目的。例如，不同菌种所耐受的头C最高浓度是不同的。技术前沿1-3.在头C的生物合成途径中，有三步反应需要氧的参与，即环化反应、扩环反应、羟化反应，因此头C发酵过程对氧的需求条件比其他抗生素发酵要求得更严苛，供氧不足，将直接影响发酵水平。目前一般通过增加搅拌功率、增大空气流量、提高罐压来解决，但会带来动力成本的大幅度增加。将一种丝状细菌

10、透明颤菌的血红蛋白基因克隆到头C工程菌中，在细胞中表达血红蛋白，提高氧的利用效率，具有良好的应用前景。技术前沿1-4.调节基因的作用可以增加或降低抗生素的产量，它常常是抗生素生物合成和自身抗性基因簇的组成部分。通过增加正向调节基因或减少负向调节基因，对结构基因 进行正向调节，加速抗生素的产生。 各种代谢产物都是通过酶的催化来形成的，而酶的产生又是受到相关基因的调控的，因此可以通过破坏分支途径的生物合成基因或破坏次要组分的生物合成基因，使发酵过程朝利于产生头C的方向进行，提高原料利用率，减少副产物的产生量。技术前沿2.连续发酵工艺的研究。技术前沿3.发酵过程的自动化控制。 青霉素是第一个进行工业

11、化生产的抗生素品种，已经实现了发酵全过程的计算机控制。头C的发酵目前还主要是依靠经验来控制，还无法进行自动化控制，主要困难在于对发酵过程中的各个参数之间以及各参数与产量的相互影响、相互调控机制的研究还不是十分透彻。但近年来，许多研究人员早已进行了相关的研究工作，并取得了一定的成果，他们在发酵动力学模型基础上，引进了一系技术前沿 列现代控制理论，如静态与动态优化、系统识别、自适应控制、专家系统、模糊控制、神经元网络等，都是基于发酵过程中各参数的高度非线性的特征而设计的。如神经元网络，是模拟人的大脑的思维方式来进行控制，在大量生产数据的基础上，通过对这些数据的“学习”,建立起和最优化生产工艺高度拟

12、合的自动化控制系统，避免人为控制的随意性，但目前离实际应用还有一定距离。 。技术前沿 有些厂家已安装了尾气分析仪，对摄氧率、二氧化碳释放率、呼吸商等参数进行在线检测，并利用相关软件进行处理分析，为头C的自动化控制奠定了基础技术前沿 4.利用代谢工程技术对发酵过程中的物质代谢流、能量代谢流进行研究。 目前所检测的各种控制参数之所以具有高度的非线性和模糊性，是因为这些参数都是在宏观水平上对发酵过程的反映，与生物的生长繁殖等初级代谢相关性较大，而与抗生素等次级代谢相关性较小，属于一种间接关系。这就要求必须在微观领域对细胞的物质代谢流和能量代谢流进行研究，揭示发酵控制中的内在规律。技术前沿 如研究生物

13、合成途径中各种中间体的代谢水平及相关酶的活性、物质转化为能量的途径、碳素流向分配、能量的储存形式及能量的流向等，这对发酵过程的控制、培养基的优化都具有重大意义。技术前沿5.头C向7ACA转化方法的研究。 51.前面已提到，酶法7ACA在国外已完全取代化学裂解法，国内厂家也逐步改用酶法生产。酶法7ACA目前有两种工艺，一种是两步酶法，第二种是一步酶法。两种方法各有所长，一般采用两步酶法，较成熟。技术前沿 两步酶法是利用D氨基酸氧化酶（由可变三角酵母产生）对头C进行脱氨反应，生成GL7ACA，然后在GL7ACA酰化酶的催化下，脱去戊二酸生成7ACA；一步法是直接利用头孢菌素酰化酶催化生产7ACA。

14、技术前沿 52.固定化细胞技术也是很有前途的研究方向。技术前沿 53. 7ACA的直接发酵生产。日本科学家将假单孢菌SE83、缺陷假单孢菌V22中的酰化酶基因克隆到头C产生菌中，改造菌在产生头C的同时，将部分头C脱酰基生成7ACA，从而使直接发酵生产7ACA成为可能。五.我集团生产情况介绍及与市场* 情况分析。 1.产能原来60吨左右，技改后70吨左右（指头C）。以后达80吨以上。 2.上马酶法7-ACA车间。今后酶法裂解和化学裂解法同时运用。 3.喷雾干燥代替结晶法。收率提高8，溶媒节省，转化率提高（头C7-ACA）。 4.滤液十亿原来2400左右，现在正常达2800以上，高者超过3000.

15、发酵水平居国内领先水平，发酵指数大于1.8。（十亿3021-31500）我集团生产情况介绍及与市场情况分析 韩国生产数据：滤液效价49787，全液32989。发酵周期160小时 国内最高据称：滤液效价42000，折合全液大约27836 （十亿2672+130带放十亿=2800）（120立方数据）我集团生产情况介绍及与市场情况分析5.产能情况。（最新数据） 目前7-ACA主要供应商中,企业的产能分别为:中润药业1500吨(实际产量1000吨,下同),健康元1200吨(900吨),福州抗生素集团1000吨(750吨),山西威奇达1000吨(500吨),哈药集团900吨(750吨),鲁抗医药600吨

16、(550吨)及联邦制药500吨(500吨)。2010年国内7-ACA理论产能为7600吨,实际产量在5500吨左右。 我集团生产情况介绍及与市场情况分析 从2010年下半年开始,各大企业的7-ACA巨资项目陆续开工及投产的消息不断传出。上述企业中,健康元已经宣布将扩大产能,达到1800吨,而联邦制药也明确将扩产达1200吨,鲁抗医药已经扩产达900吨。此外,华药6-APA车间改造转产7-ACA已经完成,并将投入11亿元用于扩产,最终将实现产能3000吨;悦康的7-ACA项目产能达2000吨;立海润7-ACA项目产能达1000吨等。 我集团生产情况介绍及与市场情况分析 这些项目都将在今年内投产。由此导致国内理论产能至少增加7600吨,国内总产能超过15000吨。 2010年7-ACA最高价格一度攀升超过1000元/公斤,市场需求十分旺盛。即使在企业逐渐加大开工率、恢复产能的情况下,12月单月平均价格依旧保持在950元/公斤左右。我集团生产情况介绍及与市场情况分析 今年，受产能增加预期的影响，7-ACA国内销价及出口价纷纷暴跌,连续6个月下滑,至2011年3月徘徊在600630元左右。部分