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1、第第8 8章章 维生素的测定维生素的测定8.1 8.1 维生素维生素B6B6的测定的测定8.2 VB28.2 VB2的测定的测定8.3 8.3 高效液相色谱法测定维生素高效液相色谱法测定维生素 维生素：维持人体生理功能所必需的、含维生素：维持人体生理功能所必需的、含量极少但具有重要生理功能的、含量极微量极少但具有重要生理功能的、含量极微的天然有机物质。的天然有机物质。 维生素种类：维生素种类： 水溶性水溶性:VB1:VB1、VB2VB2、VB6VB6、VB12VB12、VCVC 脂溶性：脂溶性：VAVA、VDVD、VEVE、VKVK 维生素维生素B1B1。保持循环、消化、神经和肌内正常功能；调
2、。保持循环、消化、神经和肌内正常功能；调整胃肠道的功能；构成脱羧酶的辅酶，参加糖的代谢；能整胃肠道的功能；构成脱羧酶的辅酶，参加糖的代谢；能预防脚气病。预防脚气病。 维生素维生素B2B2。又叫核黄素。核典素是体内许多重要辅酶类。又叫核黄素。核典素是体内许多重要辅酶类的组成成分，这些酶能在体内物质代谢过程中传递氢，它的组成成分，这些酶能在体内物质代谢过程中传递氢，它还是蛋白质、糖、脂肪酸代谢和能量利用与组成所必需的还是蛋白质、糖、脂肪酸代谢和能量利用与组成所必需的物质。能促进生长发育，保护眼睛、皮肤的健康。物质。能促进生长发育，保护眼睛、皮肤的健康。 维生素维生素B5(B5(泛酸泛酸) )。抗应
3、激、抗寒冷、抗感染、防止某些抗。抗应激、抗寒冷、抗感染、防止某些抗生素的毒性，消除术后腹胀。生素的毒性，消除术后腹胀。 维生素维生素B6B6。在蛋白质代谢中起重要作用。治疗神经衰弱。在蛋白质代谢中起重要作用。治疗神经衰弱、眩晕、动脉粥样硬化等。、眩晕、动脉粥样硬化等。 维生素维生素B12B12（钴胺素）。抗脂肪肝，促进维生素（钴胺素）。抗脂肪肝，促进维生素A A在肝中在肝中的贮存；促进细胞发育成熟和机体代谢；治疗恶性贫血。的贮存；促进细胞发育成熟和机体代谢；治疗恶性贫血。 维生素维生素B13B13（乳酸清）。（乳酸清）。 维生素维生素P P。 维生素维生素PP(PP(烟酸烟酸) )。在细胞生理
4、氧化过程中。在细胞生理氧化过程中起传递氢作用，具有防治癞皮病的功效。起传递氢作用，具有防治癞皮病的功效。 维生素维生素M(M(叶酸叶酸) )。抗贫血；维护细胞的正常。抗贫血；维护细胞的正常生长和免疫系统的功能。生长和免疫系统的功能。 维生素维生素T T。帮助血液的凝固和血小板的形成。帮助血液的凝固和血小板的形成。 维生素维生素U U。治疗溃疡上有重要的作用。治疗溃疡上有重要的作用。8.1 8.1 维生素维生素B6B6测定测定 1 1、适用范围、适用范围 本标准适用于所添加维生素本标准适用于所添加维生素B6B6的测定。的测定。 测定范围为测定范围为0.080.083.5g/mL3.5g/mL。2
5、 2、 原理用水提取，在原理用水提取，在pH7pH7条件下，用荧光法条件下，用荧光法测定维生素测定维生素B6B6。维生素B6测定 3 3、 试剂和溶液试剂和溶液 3.1 pH73.1 pH7缓冲液称取缓冲液称取29.3023g29.3023g磷酸氢二钠（磷酸氢二钠（GB 1263GB 1263）和）和3.8115g3.8115g柠檬酸，于柠檬酸，于100mL100mL容量瓶中，用煮沸后冷容量瓶中，用煮沸后冷却的水，溶解并定容至刻度。混匀备用。却的水，溶解并定容至刻度。混匀备用。 3.2 3.2 维生素维生素B6B6标准贮备溶液称取标准贮备溶液称取40mg40mg（中国药典参（中国药典参照标准）
6、维生素照标准）维生素B6B6，或复合维生素（中国药典参照标，或复合维生素（中国药典参照标准）准）B640mgB640mg， B1100mg B1100mg，B250mgB250mg（精确至（精确至0.0001g0.0001g）于）于100mL100mL容量瓶中，加水溶解定容至刻度，此液容量瓶中，加水溶解定容至刻度，此液1mL1mL含含400g400g的维生素的维生素B6B6。 3.3 3.3 维生素维生素B6B6标准工作溶液标准工作溶液 吸取（吸取（3.23.2）贮备液）贮备液1mL1mL于于100mL100mL容量瓶中加水稀容量瓶中加水稀释至刻度，混匀，此液释至刻度，混匀，此液1mL1mL含
7、含4g4g的维生素的维生素B6B6。维生素B6测定 4 4 仪器设备仪器设备 4.1 4.1 荧光分光光度计；荧光分光光度计； 4.2 4.2 分析天平：感量分析天平：感量0.0001g0.0001g。 4.3 4.3 实验室用器皿实验室用器皿 容量瓶容量瓶 1000mL 1000mL，100mL100mL，50mL50mL，25mL25mL。 刻度移液管刻度移液管 10mL 10mL，5mL5mL，1mL1mL。维生素B6测定 5 5 、分析步骤、分析步骤 5.1 5.1 试样的选取和制备试样的选取和制备 选取有代表性的试样，粉碎通过选取有代表性的试样，粉碎通过0.28mm0.28mm孔筛，
8、孔筛，用四分法缩减至用四分法缩减至100g100g，密封保存，以防试样维，密封保存，以防试样维生素生素B6B6变化或变质。变化或变质。 5.2 5.2 测定步骤测定步骤 5.2.1 5.2.1 维生素维生素B6B6的提取的提取 称取试样称取试样0.50.52g2g，（精确至，（精确至0.0001g0.0001g）于）于100mL100mL容量瓶中，加水溶解后，定容至刻度，振容量瓶中，加水溶解后，定容至刻度，振荡荡1 12min2min，静置待沉清，或离心（，静置待沉清，或离心（400r/min400r/min）10min10min。 维生素B6测定 5.2.2 5.2.2 试样的测定试样的测定
9、 移取试样的上清液移取试样的上清液1mL1mL（40gVB640gVB6）于）于25mL25mL容量瓶中，加入（容量瓶中，加入（3.13.1）pH7pH7缓冲液至刻度，混缓冲液至刻度，混匀，用匀，用1cm1cm石英比色杯，置入荧光分光光度计内石英比色杯，置入荧光分光光度计内，于激发波长，于激发波长326nm326nm、发射波长、发射波长395nm395nm测定其测定其荧光强度。荧光强度。 同时做空白试验。同时做空白试验。维生素B6测定 5.2.3 5.2.3 工作曲线的绘制工作曲线的绘制 取取0.000.00，0.500.50，1.001.00，1.501.50，2.002.00，2.50mL
10、2.50mL维生维生素素B6B6标准工作液（标准工作液（3.33.3）分别于）分别于25mL25mL容量瓶中容量瓶中，加入，加入pH7pH7缓冲液（缓冲液（3.13.1）至刻度，混匀，用）至刻度，混匀，用1cm1cm石英比色杯，置入荧光分光光度计内，于激石英比色杯，置入荧光分光光度计内，于激发波长发波长326nm326nm、发射波长、发射波长395nm395nm测定其荧光强测定其荧光强度，以荧光强度为纵坐标，维生素度，以荧光强度为纵坐标，维生素B6B6量为横坐量为横坐标，绘制工作曲线。标，绘制工作曲线。维生素B6测定 6 6 分析结果计算和表述分析结果计算和表述 维生素维生素B6B6的含量（的
11、含量（mg/kgmg/kg）按下式计算：）按下式计算： VB6VB6（mg/kgmg/kg）MD/WMD/W（1000/10001000/1000）MD/W MD/W 式中：式中：MM工作曲线上查得维生素工作曲线上查得维生素B6B6含量，含量，g/mLg/mL； WW试样的质量，试样的质量，g g； DD试样的总体积，试样的总体积，mLmL。维生素维生素B6B6测定测定 7 7 、允许差、允许差 7.1 7.1 每个试样称取两份平行测定，取算术平均值每个试样称取两份平行测定，取算术平均值为测定结果并保留两位小数。为测定结果并保留两位小数。 7.2 7.2 维生素维生素B6B6含量少于含量少于4
12、0mg/kg40mg/kg以下，平行测定以下，平行测定结果相对差值不大于结果相对差值不大于1010，维生素，维生素B6B6含量大于含量大于40mg/kg40mg/kg的平行测定结果相对差值不大于的平行测定结果相对差值不大于5 5。/P/P8.2 8.2 维生素维生素B2B2测定测定 1 1、适用范围、适用范围 本标准规定了饲料中维生素本标准规定了饲料中维生素B2B2测定方法。测定方法。 本标准适用于维生素本标准适用于维生素B2B2的测定。待测液中维生的测定。待测液中维生素素 B2B2检测浓度为检测浓度为0.050.050.2g/mL0.2g/mL。维生素B2测定 2 2、方法原理、方法原理 维
13、生素维生素B2B2（即核黄素（即核黄素C17H20N1O6C17H20N1O6）在）在440nm440nm紫外光激发下产生绿色荧光，在一定浓度范围内紫外光激发下产生绿色荧光，在一定浓度范围内 其荧光强度与核黄素浓度成正比。用连二亚硫酸其荧光强度与核黄素浓度成正比。用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光 强度之差与内标荧光强度的比值，计算样品核黄强度之差与内标荧光强度的比值，计算样品核黄素的含量。素的含量。维生素B2测定 3 3、试剂和溶液、试剂和溶液 3.1 3.1 盐酸溶液，盐酸溶液，0.1mol/L0.1mol/L：将：将8.5mL8.
14、5mL盐酸（盐酸（GB GB 622622）用水稀释至）用水稀释至1000mL1000mL。 3.2 3.2 盐酸溶液，盐酸溶液，1mol/L1mol/L。 3.3 3.3 氢氧化钠（氢氧化钠（GB 629GB 629）溶液，）溶液，1mol/L1mol/L。 3.4 3.4 冰乙酸（冰乙酸（GB 676GB 676）。）。 3.5 3.5 冰乙酸溶液，冰乙酸溶液，0.02mol/L0.02mol/L：将：将1.8mL1.8mL冰乙酸用冰乙酸用水稀释至水稀释至1000mL1000mL。 3.6 3.6 高锰酸钾（高锰酸钾（GB 643GB 643）溶液，）溶液，40g/L40g/L。 3.7
15、3.7 过氧化氢（过氧化氢（HG 31082HG 31082）溶液，）溶液，100mL/L100mL/L。现用现配。现用现配。 维生素B2测定 3.8 3.8 核酸素标准溶液核酸素标准溶液 3.8.1 3.8.1 核黄素贮备液核黄素贮备液：核黄素（中国药典参照标准）：核黄素（中国药典参照标准），于五氧化二磷干燥器中干燥，于五氧化二磷干燥器中干燥24h24h，称取，称取0.0500g0.0500g，溶，溶解于解于0.02mol/L0.02mol/L乙酸溶液（乙酸溶液（4.54.5）中，在蒸汽浴上恒速搅）中，在蒸汽浴上恒速搅动直至溶解，冷却后稀释至动直至溶解，冷却后稀释至500mL500mL。盛入
16、棕色瓶滴加甲。盛入棕色瓶滴加甲苯覆盖，低温（苯覆盖，低温（4 4）保存。）保存。 该溶液每毫升含该溶液每毫升含0.1mg0.1mg核黄素。核黄素。 3.8.2 3.8.2 核黄素贮备液核黄素贮备液：取核黄素贮备液：取核黄素贮备液（4.8.14.8.1）10mL10mL用用0.02mol/L0.02mol/L乙酸溶液稀释至乙酸溶液稀释至100mL100mL，盛于棕色，盛于棕色瓶中滴加甲苯覆盖，低温（瓶中滴加甲苯覆盖，低温（4 4）保存。）保存。 该溶液每毫升中含该溶液每毫升中含10g10g核黄素。核黄素。 3.8.3 3.8.3 核黄素标准工作液：取核黄素贮备液核黄素标准工作液：取核黄素贮备液（4.8. 24.8. 2） 10mL10mL，用水稀释至，用水稀释至 100mL 100mL。现用现配。现用现配。 该溶液每毫升中含该溶液每毫升中含1g1g核黄素。核黄素。维生素B2测定 3.9 3.9 荧光素标准溶液荧光素标准溶液 3.9.1 3.9.1 荧光素贮备液：称取荧光素（荧光素贮备液：称取荧光素（Q/HG 22786Q/HG 22786）0.0500g0.0500g，用水稀释至，用水稀
