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1、名师归纳总结 精品word资料 - - - - - - - - - - - - - - -1基因工程的首例操作试验基因工程各章学问点第一章绪论三大理论基础：DNA 是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定三大技术基础：限制性核酸内切酶的发觉与DNA的切割、 DNA 连接酶的发觉与DNA片段的连接、基因工程载体的讨论与应用基因工程的产生：72 年， P.Berg 首次实现体外DNA 重组：体外用EcoRI 分别切割SV40 和DNA, 并用 T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子73 年， S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr 的 E
2、.Coli 质粒 R6 5 和具 Tetr 的 E.Coli 质粒 pSC101 切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性S.Cohen 和 H.Boyer 首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA 与 E.Coli 质粒（ pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌2基因工程的基本概念基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳固遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA 体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA技术；供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件；3基因工程的基本操作过程a 分别目的DNA片段：酶切、 PCR 扩增、化学合
3、成等；b 重组：体外连接的DNA 和载体 DNA ，形成重组DNA分子；c 转化：将重组DNA 分子导入受体细胞并与之一起增殖；d 选择：鉴定出获得了重组DNA 分子的受体细胞；e 对获得外源基因的细胞或生物体通过培育，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物；其次章载体1懂得用 PBR322 和 PUC18 作载体的克隆外源基因的原理；答案不确定PBR322 作载体的克隆外源基因的原理 : PBR322质粒具有 12 种限制性内切酶的单一识别位点： Tetr 基因内有 7 个酶切位点： Bam H ， Sal： Amp r 基因内有 3 个酶切位点： Pst； Eco R 和 Hind 不在抗
4、生素基因内，不导致插入失活；假如在 pBR322 质粒的 Tet r 基因内位点 插入外源 DNA 片断，将切断了tetr 基因编码序列的连续性，使tetr 失去活性，产生出Amp r Tet s 表型的重组pBR322 质粒，转化入Amp s Tets 的大肠杆菌细胞；先涂布在含氨 苄青霉素的选择培育基上，选择出具Amp r 菌落，再将它们影印于含四环素的选择性培育基上；插入外源片断的重组质粒不能在这种培育基上生长，这样就找出了含重组质粒的大肠杆菌；假如在pBR322 质粒的Amp r 基因内位点 插入外源DNA 片断，就反之；PUC18 作载体的克隆外源基因的原理： 第 1 页，共 10
5、页 - - - - - - - - -名师归纳总结 精品word资料 - - - - - - - - - - - - - - -在 pBR322 的基础上，在其5-端带有一段多克隆位点的lacZ 基因，而进展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列；典型的 pUC 系列的质粒载体包括如下4 个组成部分： a、pBR322 的复制起始点；b、氨苄青霉素抗性基因 但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原先的核酸内切限制酶的识别位点；c、大肠杆菌 -半乳糖苷酶基因（lacZ ）的启动子及编码-肽链的 DNA 序列，此结构称之为lacZ 基因； d、位于 lacZ 基因中的靠近5-端的一段多克隆
6、位点（MCS ）区段；但它并不破坏该基因的功能；2抱负载体的必备条件（ 1）、较小的分子量和较高的拷贝数；（ 2）、应最大限度的具有各种常用限制性内切酶的单一酶切位点；（ 3）、具两种以上的选择标记基因；（ 4）、重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达；3穿梭载体和a-互补A 穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体；常见的穿梭质粒有大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体；B lacZ 基因的突变体M15 质粒（缺失氨基酸残基11 到 41）是没有野生型lacZ
7、基因产物那种分解X-gal才能的；但假如在M15 突变体的抽取物中加入-半乳糖苷酶的第3 至第 92 氨基酸残基的肽段（肽）就能复原 M15 分解 X-gal ，而显示蓝色的才能；这样一种基因内互补现象称做互补 ；第三章核酸操作的基本技术1碱解法提取质粒DNA 的原理？提取DNA 常常用试剂的作用原理碱裂解法是基于 DNA 的变性与复性差异而达到分别目的的；碱性使质粒 DNA 变性，再将 pH 值调至中性使其复性，复性的为质粒 DNA ，而染色体 DNA 不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去；碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA 的方法，碱变性抽提质粒 DNA 是基于染色体 DNA
8、与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分别目的；在 pH 值高达 12.6 的碱性条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；质粒 DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分别，当以 pH4.8 的 NaAc/KAc 高盐缓冲液去调剂其 pH 值至中性时，变性的质粒 DNA 又复原原先的构型，储存在溶液中，而染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体 DNA 与不稳固的大分子 RNA 、蛋白质 SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去；常用试剂的作用溶菌酶： 溶解菌体细胞壁的 -1 ，4糖苷键，即具溶菌作用；葡萄糖 ：增加溶液粘度，防
9、止 DNA受机械切力作用而降解EDTA：金属离子螯合剂，抑制脱氧核糖核酸酶（Dnase对DNA的降解作用 SDS：阴离子表面活性剂，可破坏细胞膜，使DNA释放出来，结合蛋白质，使蛋白质沉淀下来抑制脱氧核糖核酸酶（RNase的活性； 第 2 页，共 10 页 - - - - - - - - -名师归纳总结 精品word资料 - - - - - - - - - - - - - - -酚、氯仿： 蛋白质变性剂；使蛋白质失水变性，；离心后与水相（含DNA ）分别；异戊醇： 降低分子表面张力，可削减气泡的产生；有助于分相；无水乙醇： DNA 的沉淀剂；夺取DNA 四周的水分，使DNA 失水而易于聚合；
10、NaOH ： 核酸在 pH=59 的溶液中稳固，pH12 或 pH3 时会引起氢键断裂； KAc ： KAc-HAc ， pH=4.8 缓冲液，变性的质粒DNA 在此溶液中发生复性；2RNA 分别的关键因素；（ RNA 酶是一种蛋白质，所以提取时利用氯仿抽提可以很好去除，得到高质量的RNA ；） RNA 分别的关键因素是尽量削减RNA 酶（ RNase）的污染 ，因此在 RNA 制备过程中，必需留意掌握RNase 酶的活性，并设法抑制其活性；造成 RNase酶污染源有：所用的器皿、所用的溶液、试验人员的手及飞沫；玻璃器皿：烘箱中（180 烘烤 8h以上；塑料器皿： 0.1%DEPC （ die
11、thylpyrocarbonate ，二乙基焦碳酸盐浸泡或用氯仿洗涤；配置的溶液应尽可能用0.1% DEPC 在37处理 12h以上，然后高压灭菌；全部试验过程均需戴手套操作, 并常常更换；RNA 电泳槽常用去污剂洗涤，0.1%DEPC 处理；提取中显现 RNA降解缘由 ：操作过程中温度太高、操作时有RNA 酶的污染或 RNase抑制剂量不足等都有可能使RNA 降解；解决方法 ：做好使用器皿的RNase去除工作；在整个操作过程中最好在低温4 或是冰上进行；操作者自始至终戴手套；3电泳法和紫外分光光度法都能检测 DNA 的浓度和纯度，哪种方法更好；A 、紫外光度法原理： 核酸中含有嘌呤和嘧啶环，
12、在 256265nm 处显示出特点吸取峰，在 230 nm 处吸取最小； DNA 或RNA 分子在 260 nm 处有特异吸取峰，吸取强度与系统中 DNA 或 RNA 的浓度成正比；方法： 第一用 TE 或 ddH 2O 稀释待测 DNA 样品；用 TE 或 ddH 2O 为空白对比，在 260 nm 及 280 nm 处调剂紫外分光光度计读数为 0；加入 DNA 稀释液与上述两波特长读取 OD 值；A260 值为 1 时相当于 50ug/mL 的 dsDNA ， 40ug/mL 的 ssDNA 或 RNA ；通过运算公式运算浓度及纯度；双链 DNA （ ds DNA ）浓度（ g /ml ）
13、=50 OD260 稀释倍数单链 DNA 或 RNA （ ssDNA ssRNA ）浓度 （ g /ml ） =40 OD260 稀释倍数DNA 纯度可通过 OD260/ OD280 来衡量：纯的 DNA 的 OD260/OD280 为 1.82.0 ；OD260/ OD280 2.0 为RNA 污染， 1.8 为蛋白质污染； OD260/OD280 0.9 时适当稀释样品， 可再进行一次抽提； OD260/OD280 2 时就 RNA 过高，要除去 RNA ；B、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA在生理条件下，核酸分子是多聚阴离子当核酸分子被放置在电场当中时，它们就会向正电极的方向迁移；在肯
14、定的电场强度下，DNA 分子的电泳迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型；原理： 在琼脂糖凝胶中加入 EB，当与 DNA 混合时 EB 可插入到 DNA 分子中形成荧光络合物；而 EB 在 第 3 页，共 10 页 - - - - - - - - -名师归纳总结 精品word资料 - - - - - - - - - - - - - - -紫外光照耀下能发射荧光，荧光的强度与DNA的含量成正比；便可非常敏锐而便利地检测出凝胶介质中DNA 的存在、强度和谱带的位置；在适当的染色条件下，荧光的强度同DNA 数量成正比，据此，人们可 以估量 DNA 的浓度；不同大小的DNA 片段在凝胶中的迁移速度不同，据此，科研工作者们便能判定DNA 的分子质量，其有无降解；同时，通过同已知分子质量的标准DNA片段之间的比较，仍可测定出随迁移 的 DNA 片段的分子质量；4为什么核酸储存在TE 溶液（
