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1、药物色谱分析-6化学键合相色谱法齐永秀药物分析教研室一、化学键合相的特点和分类二、化学键合相填料新进展三、非极性键合相色谱法四、极性键合相色谱法五、离子交换键合相色谱法主主要要内内容容第一节第一节 化学键合相的特点和分类定义化学键合相的特点和分类定义一、特点：一、特点： 消除了担体表面活性作用点，清除了某些可能的消除了担体表面活性作用点，清除了某些可能的催化活性催化活性 耐溶剂冲洗，使用过程中固定相流失耐溶剂冲洗，使用过程中固定相流失 热稳定性好热稳定性好 表面改性灵活，容易获得重复性产品表面改性灵活，容易获得重复性产品 载样量大，溶剂残留效应小，梯度洗脱平衡快载样量大，溶剂残留效应小，梯度洗
2、脱平衡快第二节化学键合相填料新进展发展方向：提高填料的化学稳定性、热稳定性，以及改善选择性、提高分离度和适用性一、空间保护键合固定相在C18烷基的侧链引入较大官能团，阻碍硅羟基与分析物的相互作用，如异丙基或异丁基取代每个硅烷化试剂分子中含有两个硅原子，每个硅原子含有一个长链硅烷基官能团，如Agilent公司的ZorbaxExtend-C18色谱柱，在高流动相中稳定性极佳，适于分离游离的强碱性化合物二、双齿键合固定相解决利巴韦林等强水溶性药物在反相柱中分析的难题，内嵌极性官能团是改善固定相和水溶液兼容能力的途径。1、1995年Waters公司推出专利极性官能团嵌入技术，如右图三、内嵌极性基团键合
3、固定相图图9-59-5内嵌极性官能团结构示意图内嵌极性官能团结构示意图水屏蔽层能够掩蔽解离后带负电的硅羟基，减少拖尾，另可降低脱水现象，使填料和样品作用完全，在含水量高的流动相中，样品也有稳定保留和最佳峰形三、内嵌极性基团键合固定相2 2、AgilentAgilent公司的公司的Zorbax Bonus-Zorbax Bonus-RPRP色谱柱色谱柱: :内嵌酰内嵌酰胺基和三封端技术胺基和三封端技术，图，图9-89-83 3、内嵌磺胺基官、内嵌磺胺基官能团键合相，有更能团键合相，有更出色的水解稳定性出色的水解稳定性如图如图9-99-9（DionexDionex公司）公司）4 4、Phenome
4、nexPhenomenex公司的公司的Synergi Synergi Fusion-RPFusion-RP色谱柱色谱柱E E采用极性嵌合及采用极性嵌合及书疏水链来达到高书疏水链来达到高选择性的效果选择性的效果1999年Waters公司发明了杂交颗粒技术，制成了Xterra色谱柱填料具有分离效率高、峰形优良、范围宽、分析速度快，四、硅碳杂化硅胶五、优化柱床设计六、苯基丙胺键合固定相七、以氧化锆为基质的键合固定相八、包覆型填料第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）一、疏溶剂作用理论影响溶质分子色谱保留的因素溶质分子中的非极性部分总表
5、面积对色谱保留值的影响。键合相表面烷基的总表面积对色谱保留值的影响 烷基的含碳量、键合相表面的含碳量对色谱行为有重要影响洗脱液的表面张力对色谱保留值的影响第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）二、双保留机制第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）三、非极性键合相色谱法的流动相的组成基本要求:纯度高、沸点适中、黏度小、化学稳定性好、紫外吸收本底小、对样品有较宽的溶解范围、与所选的色谱系统相匹配混合溶剂的黏度一般高于纯溶剂的黏度，流动相组成变化时压力升高的现象在应用梯度
6、洗脱时应特别注意第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）三、非极性键合相色谱法的流动相的基本组成1、一元溶剂系统：一般不采用纯水系统2、二元溶剂系统：一般采用洗脱能力较弱的水作为底剂，再加入一定量与水相混溶的有机溶剂作为调节剂，如甲醇、乙腈，也可考虑四氢呋喃3、三元溶剂系统：在二元溶剂系统基础上添加四氢呋喃、三乙胺、离子对试剂、缓冲盐、醋酸、磷酸等第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则原则解释首选溶剂非极性色谱首选溶剂为甲醇、
7、乙腈、四氢呋喃，底剂为水多元溶剂由不同组别的纯溶剂与底剂（或极性调节剂）组成，一般不同时使用两个相同组别的纯溶剂洗脱能力以重点组分的容量因子为25作为溶剂系统洗脱能力的量度替代溶剂当不能达到分离要求时，可用相同洗脱能力的不同溶剂系统代替原溶剂系统。离子抑制色谱在色谱柱耐受范围内，可加入调节剂，抑制弱酸的解离或弱碱的质子化，增加其分配系数。第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则（一）中性化合物的分析减小保留值增加保留值使用碳链较短的键合相C8、C4使用碳链较长的键合相C18、使用极性低的流动
8、相，增加有机溶剂的比例使用极性大的流动相，增加流动相中水的比例提高色谱柱温度提高色谱柱温度减小色谱柱长度增加色谱柱长度第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则（一）中性化合物的分析1、改变有机溶剂的比例筛选步骤：100%100%乙腈乙腈80%80%乙腈乙腈60%60%乙腈乙腈40%40%乙腈乙腈第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则（一）中性化合物的分析2、改变有机溶剂的类型流动相的洗脱
9、强度与有机溶剂的类型有关如图：第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则（一）中性化合物的分析2、改变有机溶剂的类型一般改变有机溶剂不会影响样品的出峰顺序，但也有特例如图：第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则（一）中性化合物的分析3、使用混合有机溶剂：在二元系统不能分离时采用如图第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）四、非
10、极性键合相色谱法的流动相的设计原则（一）中性化合物的分析3、使用混合有机溶剂采用下图方法设计实验分离样品例：取代萘的溶剂选择性实验，如图例：取代萘的溶剂选择性实验，如图第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则（二）酸性化合物和碱性化合物的分析：与中性化合物分析相似，区别是加入pH值调节剂和缓冲盐。pH值的选择：目的是调节流动相的pH值或利用同离子效应，抑制样品组分的解离，增加其在固定相中的溶解度，达到分离有机弱酸弱碱的目的，称为离子抑制色谱（ISC）适于分析的3.0pKa7.0弱酸， 7.0
11、pKb8.0弱碱或两性化合物流动相对反相保留的影响与样品类型（酸、碱、中性）的关系，如图表 酸性、碱性官能团的pKa值取代基pKa酸性碱性酯基取代芳环取代酯基取代芳环取代磺酸,-SO3H11氨基酸24912羧酸-COOH4545硫醇,-SH101167嘌呤249酚,-OH1012吡嗪1亚砜,-SO12噻唑13胺，吡啶8115咪唑7哌嗪10第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则（二）酸性化合物和碱性化合物的分析：缓冲盐的选择：目的是维持组分在色谱柱的内的平衡，得到较好的重现性。要求：应具有适
12、当的缓冲容量缓冲溶液浓度应适当，一般为1050mmol/L与色谱系统相匹配，注意缓冲剂的截止波长缓冲液的挥发性，应尽量选择挥发性缓冲盐第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则（二）酸性化合物和碱性化合物的分析：胺类添加剂：在分析碱性化合物时抑制拖尾现象建立酸性和碱性样品分析方法的步骤图示分析酸性和碱性药物时的常见问题及方法分析碱性药物时会遇见的常见问题及解决方法常见问题原因解决方法色谱峰拖尾或不出峰亲醇基效应所致流动相中加入小分子有机胺使用离子对技术添加缓冲液色谱峰裂分或多重峰进样后游离药物
13、与质子化的药物在流动相中重新平衡所致流动相溶样后再进样调整进样溶液的pH值分析酸性和碱性药物时的常见问题及方法分析酸性药物时会遇见的常见问题及解决方法常见问题原因解决方法色谱峰拖尾或不出峰待测物质离子化所致调整流动相pH值至酸性加入酸性缓冲液进行离子抑制色谱峰裂分或多重峰二次化学平衡所致流动相溶样后再进样调整进样溶液的pH值第四节 极性键合相色谱法（polar bonded phase chromatography）极性键合色谱法的特性优点缺点 使用非水流动相时，色谱柱稳定 可改变流动相或色谱柱来改变分离选择性 特别适用于在水溶液中易降解的化合物 溶剂黏度低，柱压低 有机谷物多溶于正相色谱的溶
14、剂，适于制备液相 离子型样品适于非极性色谱 不易控制溶剂强度 有时柱效较非极性色谱低 低沸点溶剂易挥发或产生气泡 吸附水使样品保留不稳定，有时不能采用梯度洗脱 有机溶剂的处理成本高第四节 极性键合相色谱法（polar bonded phase chromatography）极性键合色谱相表面的基团组成：键型、主体基团和极性端基，如图第五节 离子交换键合相色谱法（ion exchange chromatography,IEC）以离子交换剂为固定相以离子交换剂为固定相, ,以缓冲液为流动相以缓冲液为流动相, ,借助试借助试样中电离组分对离子交换剂亲和力的不同而达到分样中电离组分对离子交换剂亲和力的不同而达到分离离子型或可离子化的化合物的目的的方法离离子型或可离子化的化合物的目的的方法谢谢各位！
