骨质疏松肾阳虚和肾阴虚证型下左归丸含药血清干预成骨细胞ERK1/2，Wnt/βcatenin信号通路的研究 章建华 邢婧 范连霞 尹华[摘要]該文研究骨质疏松（OP）肾阳虚和肾阴虚证型下左归丸含药血清对成骨细胞增殖和碱性磷酸酶（ALP）表达及对成骨细胞ERK1/2，Wnt/βcatenin信号通路相关因子βcatenin，ERK1，ERK2 mRNA及蛋白表达的作用采用手术去卵巢法造成大鼠骨质疏松模型，并在手术10周后，分别注射氢化可的松、灌胃甲状腺素造成大鼠OP肾阳虚及OP肾阴虚模型；用新生24 h乳鼠颅骨体外培养得成骨细胞，以碱性磷酸酶和茜素红染色进行鉴定，分别用OP肾阳虚、OP肾阴虚及OP组（对照组）所得的左归丸含药血清、空白血清干预成骨细胞，采用MTS法检测细胞增殖情况，ELISA法检测ALP表达，RTPCR法检测ERK1/2，βcatenin mRNA的表达，Western blot法检测ERK1/2，βcatenin蛋白表达结果表明：OP肾阴虚证型下左归丸含药血清在促进成骨细胞增殖、ALP表达、成骨细胞ERK1/2，Wnt/βcatenin信号通路相关因子βcatenin，ERK1，ERK2 mRNA及蛋白表达方面比OP肾阳虚证型下左归丸含药血清的作用更强。
这与“左归丸滋肾阴”的中医理论相吻合，为临床辩证治疗骨质疏松症提供科学依据左归丸通过ERK1/2和Wnt/βcatenin信号通路调控成骨细胞的增殖与分化，可能是左归丸防治骨质疏松肾阴虚证的机制之一[关键词]左归丸； 成骨细胞； 含药血清； 骨质疏松肾阳虚； 骨质疏松肾阴虚； Wnt/βcatenin信号通路； ERK1/2信号通路[Abstract]To clarify the effects of Zuoguiwan containing serum on osteoblast proliferation and alkaline phosphatase（ALP） expression and its effects on the expression of βcatenin， ERK1， ERK2 mRNA and protein of osteoblast through ERK1/2， Wnt/βcatenin signaling pathway in models with osteoporosis（OP） kidneyYangdeficiency， osteoporosis（OP） kidneyYindeficiency syndrome Rat osteoporosis models were established by ovariectomy surgery， and 10 weeks after surgery， hydrocortisone was injected and thyroxine was administered by intragastric administration to establish OP kidneyYangdeficiency rat model， and OP kidneyYindeficiency rat model Osteoblasts were obtained from 24 h newborn rat skull and were identified by alkaline phosphatase and alizarin red staining Zuoguiwan containing serum of OP， OP kidneyYangdeficiency， and OP kidneyYindeficiency， as well as the blank serum were used to intervene the osteoblast， and the cells proliferation was detected by MTS ELISA assay was used to detect ALP expression RTPCR assay was used to detect the mRNA expression of ERK1， ERK2， βcatenin and protein expression levels were detected by Western blot The results showed that Zuoguiwan containing serum in OP kidneyYindeficiency model had stronger effect than OP kidneyYangdeficiency in promoting osteoblast proliferation， ALP expression， osteoblast ERK1/2， Wnt/βcatenin signaling pathway related factors βcatenin， ERK1， ERK2 mRNA and protein expression levels This was consistent with the TCM theory of "Zuoguiwan nourishes kidney Yin"， providing a scientific basis for the clinical and dialectical treatment of osteoporosis Zuoguiwan could regulate the proliferation and differentiation of bone cells by ERK1/2 and Wnt/βcatenin signaling pathway， which may be one of the mechanisms of Zuoguiwan for the prevention of osteoporosis.[Key words]Zuoguiwan； osteoblasts； drug containing serum； OP kidneyYangdeficiency； OP kidneyYindeficiency； Wnt/βcatenin signaling pathway； ERK1/2 signaling pathwayendprint骨质疏松症（OP）是机体自然衰老、退化过程的表现，以骨量减少，骨小梁变细、断裂、数量减少，骨皮质多孔、变薄为特征，并由此导致骨的脆性增高及骨折危险性增加的一种全身性骨代谢性疾病。
随着社会人口老龄化的日趋严重，骨质疏松症已成为常见病中医学将骨质疏松归属于“骨痹”[1]，认为肾虚是本病的主要病机[28]，故中医药治疗骨质疏松症多从补肾入手，实验室与临床研究结果均显示该治疗主方向的有效性[3，912]根据个体的体征差异，主要有肾阳虚和肾阴虚2种证候补肾名方左归丸，始载于明朝张介宾所著《景岳全书》中，方中熟地黄、枸杞、菟丝子、山茱萸、山药、鹿角胶、龟板胶、牛膝共用，具有滋补肾阴的功效基于中医理论辨证论治的思想，本课题借助骨质疏松肾阳、肾阴虚证型制备左归丸的含药血清与空白血清，分别干预成骨细胞，通过检测细胞增殖情况、ALP表达情况以及与ERK1/2，Wnt/βcatenin信号通路相关的各因子mRNA及蛋白表达情况，研究骨质疏松肾阳、肾阴虚证候下左归丸含药血清干预成骨细胞ERK1/2，Wnt/βcatenin信号通路作用的差异，从而阐释左归丸“辨证”治疗骨质疏松症的作用机制和理论基础1材料11动物清洁级SD大鼠，雌性，体质量（200±20） g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（沪）20080016，用于骨质疏松不同证型的制备及含药血清的制备；新生24 h内乳鼠，用于成骨细胞的分离培养。
12试药与试剂熟地黄（130807，产地：河南）、山药（140226，产地：浙江）、枸杞（140211，产地：宁夏）、山茱萸（131115，产地：浙江）、牛膝（141225，产地：四川）、菟丝子（141204，产地：辽宁）、肉桂（131226，产地：广西）、鹿角胶（20120103，产地：河南）、龟板胶（20120103，产地：河南），均购自华东医药股份有限公司药材参茸分公司，经浙江中医药大学张如松教授鉴定为正品Ⅰ型胶原酶（Gibco分装）；DMEM高糖型培养液（Hyclone）；胎牛血清（Gibco，USA）；025%胰酶EDTA（Sigma，USA）；001 mol·L-1PBS（吉诺生物医药技术有限公司）；红细胞裂解液（碧云天生物科技）；碱性磷酸酶染液（南京建成生物工程研究所）；茜素红（Sigma，USA）；MTS（Promaga，0000094244）； RIPA裂解液（批号00011401，康为生物）；蛋白酶抑制剂混合物（WBP1265，达文生物）；ALP含量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白定量试剂盒（00061311，康为世纪）；甘氨酸（amresco，9978c366）；十二烷基硫酸钠（SDS）（amresco2227）；AP（amresco0496）；TEMED（上海远慕科技）； Trisbase （amresco0497）；TBST缓冲液（上海樊克生物）； 15 mol·L-1 TrisCl （pH 88），10 mol·L-1TrisCl（pH 68）（碧云天生物科技）；5×SDS上样缓冲液、预染marker（康为世纪）；PVDF膜（K4AA7969，Immobilon）；1×TAE电泳缓冲液、溴化乙锭溶液（EB）、琼脂糖、6×加样缓冲液、细胞总RNA提取试剂盒（杭州宝赛生物，RE02050）；Dnase I（Promega，M6101）；反转录试剂盒（杭州宝赛，RT02020）；荧光定量试剂盒（杭州宝赛，PM10003）。
Western blot所需抗体见表113左归丸药液的制备按处方量称取各味药材，左归丸：熟地黄24 g、山药12 g、枸杞12 g、山茱萸12 g、牛膝9 g、菟丝子12 g、龟甲胶12 g、鹿角胶12 g，分别加入10倍量50%乙醇，室温下浸泡1 h，45 ℃条件下超声提取30 min，2次，合并药液，过滤，减压浓缩至生药4 g·mL-1，4 ℃保存备用14仪器Sartorius BS110S 1/1万电子天平（德国塞多利斯公司）；Heidolph 5804R超速冷冻离心机（德国海道夫公司）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SENCO R系列旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；CO2培养箱（德国赛默飞世尔科技有限公司）；超净工作台（苏州苏净公司）；多功能酶标分析仪（德国赛默飞世尔科技有限公司）；旋转式恒温振荡仪（江苏培英公司）；Odyssey双波长成像系统（Licor，美国）；电泳仪（BioRad，美国）；定量PCR仪（安捷伦，Agilent Stratagene Mx3005P）；微量离心机（美国AndyBio公司，AndyBio Mcentrifuge）。
2方法21动物模型的建立与评价取SD雌性大鼠，分成正常组与模型组，正常组行假手术，切除卵巢附近一小块脂肪，模型组切除双侧卵巢造成骨质疏松模型将模型组分成OP组、OP肾阴虚组、OP肾阳虚组OP肾陽虚组于术后10周开始，每日臀部肌肉注射氢化可的松，剂量为0025 mg·g-1，连续10 d；OP肾阴虚组于术后第10周开始，每日灌胃给予甲状腺素，剂量为016 mg·g-1，连续10 d造模期间观察记录OP组、OP肾阴虚组、OP肾阳虚组动物的一般行为状态、体质量、肛温，并且测定血清cAMP和cGMP的含量。