实验三固体纤维素酶滤纸酶活力（FPA）的测定方法一、目的了解纤维素酶的种类和测定原理，掌握其活力的测定方法二、原理1. 纤维素酶是一类分解纤维素的复合酶，目前公认的有四种：（1）内切3-1,4-葡聚糖酶;（2）外切P -1,4-葡聚糖酶；（3）纤维二糖水解酶；（4）纤维二糖酶（B ■葡聚糖昔酶2. 纤维素酶水解纤维素产牛的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基 水杨酸（DNS）述原，生成红棕色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定 范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就 可测定纤维素酶的活力由不同底物测得的酶活力分别称作FPA （滤纸糖酶活力）和CMCA （竣甲基纤维素酶活 力）纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物（滤纸）水解，释放岀还原糖在碱性、煮 沸条件下，3, 5 一二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原 糖（以葡萄糖计）含量成正比通过在540 nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出 纤维素酶的滤纸酶活力以此代表纤维素酶的酶活力酶活定义以滤纸为底物，在一定反应条件（50°C, pH4.8,恒温lh）下，以水解反应中每小时催化底物水解形成lpmol葡萄糖的酶量为一个单位（U）。
三、试剂和溶液 （一）除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸徭水或去离子水或相当纯度 的水1.DNS试剂称取3, 5—二硝基水杨酸（10+0.1） g,置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠10 g, 在50°C水浴中（磁力）搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚（重蒸）2g和无水亚硫酸 钠5g,待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至lOOOmL,过滤贮存于棕色试剂 瓶中，于暗处放置7d后使用2•柠檬酸缓冲液，0. 05 mol/L pH 4.8（适用于酸性纤维素酶）称取一水柠檬酸4.83 g,溶于约750 mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g, 用水定容至1000 mL调节溶液的pH到（4.8 士 0.05）备用注:也可采用pH4.8乙酸缓冲溶液:称取三水乙酸钠8. 16 g,溶于约750 ml,水中，加入乙酸2.31 ml,,用水定容至1 000 ml•调节溶液的pH到（4.810.05）备用3•葡萄糖标准贮备溶液（10mg/ml）称取于（103 士 2）°C下烘千至恒重的无水葡萄糖1 .Og,精确至0. 1 mg,用水溶解并定容至 100ml 4 •葡萄糖标准使用溶液分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0. 00, 1. 00, 1.50, 2.00, 2.50, 3.00, 3.50 mL于10ml容量瓶中，用水定容至10 mL,盖塞，摇匀备用。
上述系列浓度应根据需要白行调整5•快速定性滤纸（杭州新华一号滤纸）沪15 cm（每批滤纸，使用前用标准酶加以校正）二）仪器除普通实验室仪器外，还应有:1分光光度计 2酸度计精度10.01 pH3恒温水浴（50 士 0.1）0C4分析天平感量0.1 mg5磁力搅拌器 6秒表或定时钟 7沸7k洛（可用800W申炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成）8具塞刻度试管25 mL四、操作步骤4・1绘制标准曲线按表A. 1规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液和DNS试剂A21于各管 中（每管号平行作3个样），混匀将标准管同吋置于沸水浴中，反应10 min取出，迅速冷却至室温，用水定容至25 mL. 盖塞，混匀用10 mm比色杯，在分光光度计波长540 nm处测量吸光度以葡萄糖量为横 坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程线性回归系数应在0.9990 以上时方可使用（否则须重做）表1葡萄糖标准曲线管号葡萄糖标准使用溶液缓冲液吸取量mLDNS试剂吸取量mL浓度mg/mL吸取量mg/mL00.00.02.03.011.00. 51.53.021.50. 51.53.032.00. 51.53.042.50. 51.53.053.00. 51.53.063.50. 51.53.04・2样品的测定 4.2.1待测酶液的制备称取固体酶样1 g,精确至0.1 mg（或吸取液体酶样1 mL,精确至0. 01 mL）,用水溶解, 磁力搅拌混匀，准确稀释定容50ml（使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围 内），放置10 min,待测。
4.2.2滤纸条的准备—将待用滤纸放入（硅胶）干燥器中平衡24h:一将水分平衡后的滤纸制成宽I cm、质量为（5.0+5）mg的滤纸条，折成M型备用4.3操作程序—取四支25 mL刻度具塞试管（一支空白管，三支样品管）—将折成M型的滤纸条，分别放入每支试管的底部（沿lcm方向竖直放入）—分别向四支管中，准确加入相应pH4.8的缓冲溶液1. 50 mL —分别准确加入稀释好的 待测酶液0.50mL于三支样品管中（空白管不加），使管内溶液浸没滤纸，盖塞—将四支试管同时置于（50 士 0.1）°C水浴中，准确计时，反应60 min,取出—立即准确地向各管中加入DNS试剂3.0mLo再于空白管中准确加入稀释好的待测酶液 0.50 mL,摇匀将四支管同时放入沸水浴中，加热10 min,取出，迅速冷却至室温，加水 定容至25 mL,摇匀—以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长540 nm下，用10 mm比色杯，分別测量三支平行管中样液的吸光度取平均值以吸光度平均值查标准曲线或用线性回归方程求岀还原糖的含量底物（滤缓冲液吸取量DNS试剂吸取量管号纸）浓度mgmL酶液mL反应时间mLlh （加酶液7对照501.50.00. 5ml)3.08501.50.5lh3.09501.50. 5lh3.010501.50. 5lh3.04.4结果计算X=Ax l/0.5xn 式中：X—样品的滤纸酶活力（FPA）, u/g（或u/mL ）;A—根据吸光度在标准曲线上查得（或计算出）的还原糖量，mg;1/0.5—换算成酶液1 mL;n酶样的稀释倍数。
5 •允许差同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10 %o变异系数不超过10%e。