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1、体外分析技术一、概论体外标记免疫分析是当今先进的超微量检测技术，它的测量值可精确到亳微克（ng）微微克 （pg）,甚至达毫微微克级（fg）,它的基础是先进的放射性或非放射性标记技术和先进的抗原一 抗体结合的免疫技术。它主耍被用于检测人体的各种激素和各种肿瘤标志物。是当前的重耍检测技 术z。体外标记免疫分析技术起始于1959年，由美国的Bcrson和Yalev共同建立了放射免疫分析法 （RIA）,由于RIA具有灵敏度高、特异性强、重复性好、测量简便、成本低等优点。在生物学和医 学中対机体超微量活性物质的分析取得重要突破而获得飞速的发展，故Yal（丹在1977年获得诺贝尔 奖。但因RIA法必须使用
2、放射性物质，所以在发展中受到一定限制。自70年代起科学家们曾先后研究 并建立了多种菲放射性物质的标记免疫分析，如酶标记免疫分析（EIA）、时间分辨荧光分析（TRFIA）、 酶放大发光分析（CLEIA）、化学放光（CLIA）、电化学发光（ECLRA）等,并且可进行仪器的全自 动化测定和全自动的数据分析。各种测定方法主要是标记技术、标记品的不同而采用的测量方法不同，各具特点和优点，其棊 木原理还是标记免疫技术，其中最基本的还是放射免疫分析和免疫放射分析。二、放射免疫分析的基本原理放射免疫分析法（Radioimmunoassay, R1A）是建立在放射性分析的高度灵皱性与免疫反应高度 特异性基础Z上
3、的超微量分析技术。通过测定放射性标记抗原一抗体复合物的量来计算出待测抗原 （样品）的量。2011上纪50年代末Berson和blow在研究胰岛索抗体时，首先了建立放射免疫分析法定 量测定胰岛索含量，从而开创了生物活性物质微量测定分析的新时代，从此放射免疫分析技术以其 灵敬度高、特异性强、重复性好、准确度高等优点而独树一帜。日前应用放射免疫分析技术能测定 生物活性物质达300余种，被广泛应用于生物学医学各个领域。放射免疫分析法的棊木原理是竞争性抑制反应。设定限量的特异性抗体（Ab）与一定量的特异 性标记抗原（林g）在一定条件下发生免疫反应，形成标记抗原一抗体复合物（*Ab）。如在上述 反应体系中
4、加入非标记的抗原（Ag）,则非标记抗原和标记抗原与限量抗体间发生了竞争性结合的 抑制反应。当反应平衡后，将反应体系中的标记抗原一抗体复合物（B）与游离的标记抗原（F）分 离，测定标记抗原-抗体复合物的放射性（每分钟计数cpm）,通过计算，求出非标记抗原的量（图1）Ag + Ab AgAb + AgV+*Ag*Ag+ *AgAb图i放射免疫分析法的基本原理可以看到，在反应体系中由于标记抗原和抗体都是限量的，随着投入的非标记抗原量的增大， 标记抗原和抗体的结合量被抑制降低此即为“竟争性抑制反应”。在实际应用时，用一组不同浓 度的标准品抗原，在相同条件下，和标记抗原与抗体发生竞争性反应，随着标准品量
5、的逐步增大， 标记抗原-抗体结合率则逐步降低（图2）,以标准品抗原浓度作为横坐标，以标记抗原-抗体复合物 的结合率（B%）作为纵坐标，绘制标准|11|线，测量待测样品的标记抗原-抗体复合物的放射性结合率 （B%）,即可自标准曲线上查得被测样品相应的含量。标准品抗原浓度图2放射免疫分析法的标准曲线三、免疫放射分析的基本原理免疫放射分析（Inunu nor ad iometric assay , IRMA）于1968年由Hiles和Hales所建立,它是利用 放射性标记抗体作为示踪剂与非标记抗原（标准品或待测样品）形成复合物后，弃去多余的游离 的标记抗体，测量抗原-标记抗体复合物的放射性，绘制标准
6、曲线，测量所得的复合物的放射性和非 标记的抗原量成iE相关。曲于反应体系中使用过量的抗体，故灵敏度比放射免疫分析有明显提高， 且标准曲线的测量范围也明显扩大。免疫放射法的主要特点是：1.属于非竞争性抗原抗体结合反应2.抗原-抗体复合物的量与所测非 标记抗原的量成jE比3.免疫放射分析法的非特异性结合对低剂量区的影响很大，因此对分离条件的 要求特别严格。虽然免疫放射分析有着诸多优点且也早己建立方法，但直至八I年代单克隆抗体技术推广之后, 才被广泛的应用，这是因为免疫放射分析需要大量的标记抗体Z故。四、放射免疫分析和免疫放射分析的比较此两者分析技术的比较见表1表1放射免疫分析和免疫放射分析的比较放
7、射免疫分析免疫放射分析标记物抗原抗体原理竞争性抑制反应非竞争性结合反应抗体限量过量标准曲线负相关正相关达到平衡的速度慢快可测范围窄宽应用对象大分子.小分子大分子五、标记免疫分析的构成条件放射免疫分析其基本的构成条件有四，即抗体、标记抗原、标准品（抗原）和分离剂（方法） 而免疫放射分析则是标记抗体、标准品（抗原）和分离剂（方法）（）抗体放射免疫分析LI前使用的抗体基木上是多克隆抗体，也有川单克隆抗体的，免疫放射分析则多 是单克隆抗体，制备抗体首先要纯化抗原，对于分子化合物，需先要将小分子物质和蛋门质分子连 接才能成为有效的免疫源，才能免疫动物而得到抗体。此时该小分子化合物称为“半”抗原。衡量抗体
8、质量的指标有（1）抗体的亲和力（2）抗体的特异性（3）抗体的滴度。抗体的亲和力表示抗体和抗原结合的能力，亲和力高，抗原抗体易结合和结合后不易解离。特 异性标志抗体和抗原结构类似物不易发生交叉反应。如特异性不髙，则抗原类似物也能和抗体结合 影响分析结杲。滴度是指抗体实际应用时稀释度，滴度越高，所需的抗血清（抗体）量就趣少，稀 释度通常均在1： 1000以上，亲和力高、特异性强的抗体才能建立高灵敏和高特异的标记免疫分析。（二）标记抗原（标记抗体）放射免疫分析或免疫放射分析，口前使用的大都是咯I核索，少数系用的是勺核索。I标记抗原 （抗体）应用丫计数器测量,成本低廉和方法简便平测量则要用液体闪烁计数
9、器测量，测量成木 较高也比较繁复。对标记抗原或抗标记抗体的主要要求是（1）标记后不改变原有抗原的生物学活件 （免疫活性、特界性等）（2）标记的放射性核索的半衰期不能太短，以保证试剂盒的制造，运输 和分析过程所需，鬥的半衰期为60天，其标记抗原商品流程可达4飞周。许啲半衰期为12. 3年，多为 生物学或基础医学所用。（3）要求有足够的比活度，以保证放射免疫分析或免疫放射分析的灵墩度。（三）标准品（抗原）标准品实际上是已知含量并呈梯度浓度的系列标准抗原，做分析的标准曲线Z用。其免疫活件 必须相同于被测物质口定量要准，是定量分析的凭借和依据。（四）分离剂反应达到平衡后，必须将标记抗原-抗体复合物和游
10、离的标记抗原分开，以便分别测量放射性B 或F,游离抗体及非标记抗原无放射性，不干扰测量，由于抗原抗体复合物是大分子，游离抗原是小 分子，因而凡能使大分子和小分子物质分离的方法均适用，U前常用的分离方法分为两大类。（1）液相分离技术抗原抗体在液相环境起反应，常川的分离方法为3种。双抗体沉淀法。当抗体和抗原反应结束 后，加入抗第一抗体的抗体，称为第二抗体，形成抗原-第一抗体-第二抗体的复合物。通过离心沉 淀即可收集和测量。聚乙二醉（PEG）沉淀法。PEG能使复合物沉淀现常用第二抗体-PEG联合沉 淀法，分离效果既快又好。（2）固相分离技术周相分离技术是预先将抗体吸附在某种尚体支持物上，抗原、抗体的
11、反应就在支持物上进行， 反应结束后只需将未结合的游离抗原弃去，测定固体支持物上的放射性即可，现常用周相支持物的 材料有聚乙烯、聚苯乙烯等塑料和纤维索，磁性颗粒等。六、标记免疫分析的质量指标实验分析总体性能的观察指标是稳定性，存该实际分析试剂材料的有效期内，其各个测量参数 和标准讪线形态以及参考样品的测定値均应基本稳定。而对于该实验分析的棊本性能指标主要有4 点。（1）粘密度：指同一样品重复测定的实际值的离散程度，离散程度越小，实验分析系统的粘密度就 越高。（2）灵敏度:指实验测定中经统计学处理，能与零剂量相区别的最小量，在实际工作中还需注意其 有效测定范围。（3）特异性：实验分析対被测物的特异
12、性决定于所用抗体的特界性（4）准确度：准确度是指样品的测定值偏离真值的程度。由于实际样品的真值是未知的，常用的估 计准确度的方法是测定实际样品加标准品的回收率。综前所述，标记免疫分析体系中最重点的是抗体的质量和标记抗原的质和量。七、标记免疫分析的质量控制鉴于标记免疫分析是一种超微量的定量分析技术，因此必须要加以质量控制，以保证检测结果 的可靠性。质量控制就是对分析工作的误差进行经常性的检查，将误差控制在可接受的范圉内。如 有质量异常，则及时采取对策，以校正、改进标记免疫的质量控制，包括实验室内部质量控制 和实验室间的质量评估两大方面。（一）内部质量控制实验室误差分为两大类：随机误差及系统误差。
13、前者出现纯属随机现象，如测定体系中各个样 品的加样，分离，测量等步骤的差异引起复管误差过大。后者的出现则是由于整批实验发生了某系 统变化，使很多样品受到类似的影响，例如标准品浓度不准或火活，抗体的效价降低等等，而导致整批样品测定值的偏高或偏低。随机误差是不可避免的，要求批内误差变异系数5%,批间的变异系 数10%。而系统误差则可以校止而避免。内部质控就是要通过严格操作规程來进行控制，亦nJ通过 同批检测的参考血清來观察。(%1) 实验室间的质量评估这种实验室间的质量评估由地区性或全国性机构就一些项II対个实验室的结果进行比较，得到 共同性或个别性的性息，提供行政主管部门，生产厂家和各实验室参考
14、。八、各种非放射标记免疫分析技术放射免疫分析法和免疫放射分析法，经数I年來的应川和发展，是相当成熟的技术，具有方便、 稳定、成木低、实用价值大等优点。对医学研究和临床诊断起了极大的推动作用。但是由于存在放 射性污染和难以实现自动化操作，很多学者早已在研究建立各种#放射性标记免疫分析和实现快速 的自动化操作。近年来，已完成了多项非放射性标记免疫分析的自动化技术，优点是无放射性污 染自动化操作减少了随机误差灵敏度更高测定快捷，报告及时，尤其适宜大批样木的测定。 从免疫分析的角度來看，其原理是相同的，只是标记物是非放射性的，其最厉的信号不是射线，而 是其他物理形式，探测技术(仪器)齐有不同。目前常用
15、的为下类四种非放射性标记免疫分析技术(%1) 化学发光免疫分析 (Chemiluminescence Immunoassay, CLE1A)化学发光免疫分析是用能产生化学发光的化合物代替放射性标记物，最常用的发光化合物是异 鲁米那或口丫噪酯，他们在碱性条件下遇到过氧化物便发生单光子发射，这种方法不需要外源性激发 光源，避免了木底光和杂散光的干扰，大大提高了信噪比，因此有很高的灵敏度,但这种方法的发 光时间集中在加入过氧化物或碱的短时间内，测量时间极短，必须严格掌握。(%1) 酶放大化学发光免疫分析(Chemiluminescence Enzyme Immunoassays CLEIA)本法标记物是碱性磷酸酶标记的抗体，经过夹心法免疫反应(和IRMA相似)复合物带有臨标记, 加入底物金刚烷，在碱性磷酸酶作用下底物断裂，同时发射光子，由于酶反应持续一段时间，发射 光壬的过程明显比上述单纯化学发光长，而口在一段时间内维持稳定，所以木法的稳定性较高。(%1) 电化学发光免疫分析 (Electorchemluminescence Immunoassay ECU)电化学发光反应的底物三联毗I钉被作为标记物制成标记的抗原或抗体，测定模式分两个步骤, 以双抗夹心法测定抗原为例，先曲三联毗唳钉标记的抗体，吸附奋磁性微球上的固和抗体与受检样 木在试管中反应，反应后进入反
