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1、 质粒的酶切 酶切片段的回收 酶切片段的连接 亚克隆流程示意 酶切产生的末端（1） G A TA T C C T AT A G EcoR酶切产生平端 G A T PA T C C T AP T A G（2） GA A T T C C T T A AG EcoR酶切产生5突出粘端 G PA A T T C C T T A AP G (3） C T G C AG GA C G T C Pst酶切产生3突出粘端 C T G C A PG GP A C G T C限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编
2、号、分离顺序。例如：Hind前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“”表示菌系为型血清型；“”表示分离到的第三个限制酶。EcoRIEscherichia coli RI HindHaemophilus influensae d SacI (II)Streptomyces achromagenes I () 酶切反应限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。20l体积反应体系如下： A: 质粒（pGEM-1808 或pET21a） 0.5g B: 10酶切buffer 2.0l C: Hind 0.5l D: EcoR 0.5l E: 加ddH2O 至20l37水浴消化1
3、小时。 酶切示意图EcoR EcoR EcoR EcoR pGEM-NGFNGFNGF酶切pGEM载体EcoR EcoR 质粒的酶切电泳琼脂糖冻融法回收、纯化DNA片段1. 在紫外灯下仔细切下含所需DNA片段的胶条（小于0.6g） 捣碎，置于1.5ml离心管中。2. 加入等体积的Tris-Cl饱和酚（pH 7.6），振荡混匀； -20放置5-10min待结冻；3. 10000rpm5min，上层液转移置另一离心管中；4. 原管加入1/4体积H2O于含胶的离心管中，振荡混匀； -20放置5-10min待结冻；5. 10000rpm5min，合并上清液；6. 用等体积酚/氯仿抽提2次、氯仿抽提1次
4、， 取上清于新微量离心管；7. 加入1/10体积3M NaAc（pH 5.2），2.5倍体积预冷的 无水乙醇，-20，放置30min（或过夜）；8. 13000rpm10min，弃上清；75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；9. 适量H2O或TE溶解；电泳检测。关于连接酶定义：ATP存在下，在3OH和5 P之 间形成磷酸二酯键。特性：连接粘端的效率远高于平端。策略： 1.首选不匹配粘端 2.次选匹配粘端，载体脱磷 3.平端连接，提高酶量单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式* *1313 不匹配粘端连接图示单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式* *1414 匹配粘端连接图示
5、单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式* *1515 平端连接图示 DNA片段的连接反应连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行1. 10l体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一 定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为11-15），补ddH2O 至8l。2. 轻轻混匀，稍加离心，置56 5min， 迅速转入冰浴。4. 加入含ATP的10Buffer 1l。5. T4 DNA连接酶1l。6. 稍加离心,14-16连接8-14hr。T-A连接NGFNGFPCR产物AATTpGEM-TpGEM-NGF连接单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式* *1919连接产物的蓝白斑鉴定
