免疫共沉淀实验原理及方法免疫共沉淀( CoIP)概述及原理免疫共沉淀 ( Co-Immunoprecipitation ,CoIP)是研究蛋白 - 蛋白间相互作用的经典方法,属于 免疫沉淀技术 的一类, 常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分 免疫共沉淀的设计理念是, 假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员, 那么利用这种蛋白的特异性抗体,就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来(常说的“ pull - down”), 进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员 免疫共沉淀的特点可以概括为两点, 第一是天然状态,第二是蛋白复合物免疫共沉淀的优势:与其他研究蛋白质相互作用技术(如 GST-Pull down、酵母双杂交等)相比,免疫共沉 淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合, 避免了人为的影响, 因此符合体内实际情况,得到的蛋白可信度更高免疫共沉淀的局限性和注意事项:1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上, 意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到;2. 由于蛋白质形成复合物以后,某些表位就会被掩盖,因此可能导致使用某一种pull-down 抗体,无论怎么增加抗体浓度, 也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来, 如有必要最好使用多种不同抗体分别进行 CoIP ;3. 由于检测的是天然状态, 因此在不同的时间和不同的处理下, CoIP 拉下来的蛋白复合物都可能是不同的,当然随着实验次数的增加,得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大;免疫共沉淀的一般操作流程(中英文对照):4. 如果使用 Western Blot 的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白,则需要在试验前进行预测,具有一定的冒险性; 当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题, 但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事,并且成本较高;5. CoIP 鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用, 进一步区分还需要进行 GST-Pull down 等实验检测;6. 为了保证 CoIP 实验的可靠性和严谨性,需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP 实验,并且结果应该能够彼此验证,因为原则上使用复合物的任一成员进行 CoIP 都会得到其他所有成员 [1]1. 用预冷的 PBS洗涤细胞两次;2. Carefully wash cultured cells with pre-chilled PBS for 2 times.3.4. 2. 加入预冷的 RIPA 裂解缓冲液( 107 细胞加入 1ml);5. Add in cold RIPA lysis buffer (1ml for 107cells).6.7. 3. 用预冷的细胞刮将细胞从培养介质上刮离,并转移到干净的管中。
并置于低速摇床,4℃缓慢晃动 15min ;8. Scrap cells off to clean eppendorf tubes with a clean, cold scraper. Put them on a low-speed rotating shaker for 15 mi n at 4 °C.9.10. 4. 4 ℃, 14000g 离心 15min ,立即将上清转移到一个新的离心管中11. Centrifuge at 14,000 g 4 °C for 15min, transfer the supernatant to new tubes immediately.12.13. 5. 将 Protein A/G-agarose 微球用 PBS 洗两遍,用 PBS 配制成 50%的 protein A/G-agarose 工作液;14. Wash protein A/G-agarose beads for 2 times with PBS and make a 50% protein A/G agarose working solution (in PBS)15.16. 6. 在样品中以每 1ml 中加 100μl 的比例,加入 50% 的 Protein A/G agarose 工作液。
水平摇床 4℃摇动 10min(该步骤的目的是去除非特异性结合的蛋白)17. Add in 50% protein A/G agarose with ratio of 100 μl for a 1ml sample solution.Shake on horizontal shaker for 10min, 4°C (This step aims to eliminate non-specific binding proteins)18.19. 7. 4℃,14000g 离心 15min,将上清转移到一个新的离心管中, 去除 protein A/G-agraose微球;20. Centrifuge 14,000g at 4°C for 15min, transfer the supernatant to new tubes and discard protein A/G-agraose beads21.22. 8. 使用 BCA法或者其他方法测定总蛋白的浓度23. Quantify total protein with BCA assay or other methods.24.25. 9. 用 PBS 将总蛋白稀释到 1 μg/ μl 以降低裂解液中去垢剂的浓度。
如果你觉得你的目的蛋白的浓度低了,你可以将总蛋白浓度提高到 10 μg/ μl (假设浓度够的话)26. Dilute the total protein to 1 μg/ μl with PBS to decline the concentrations of detergents. If you feel the concentration of your target protein is low, youcan dilute the total protein to 10 μg/ μl. (if it ’s high enough)27.28. 10. 加入一定体积的一抗,至总体积约为 500μl ;29. Add in appropriate amount of primary antibody to approximately 500 μl total volume.30.31. 11. 用摇床缓慢摇动抗原抗体混合物, 4℃过夜32. Slowly shake antigen- antibody complex on rotating shaker at 4°C for overnight.33.34. 注意:如果如果下游用于激酶或磷酸酶的酶活测定,则最好将 11 步改为室温孵育 2h;35. Note: if downstream experiment is enzyme activity assay for kinase or phosphatase, it ’s better to change step 11 to a 2h incubation at roo m temperature.36.37. 12. 14000g 离心 5s,收集沉淀,并且用预冷的洗涤缓冲液(或者预冷的 PBS)洗涤 3遍(每次加入 800μl )38. Centrifuge 14,000g for 5s, keep the pellet and wash with pre-chilled washing buffer (or cold PBS) for 3 times. (800 μl each)39.40. 13. (用合适体积的上样缓冲液重悬)收集上清,用于进一步的下游 SDS-PAGE, western-blot 或者质谱分析41. Collect the supernatant to proceed to SDS-PAGE, western-blot, or mass spectra analysis.42.43. 注意:该 CoIP 操作步骤是将抗体先结合到 Protein A/G-argarose 微球上,然后再与抗原混合。
相对其他方法,最终的得率较低,但避免了抗体共洗脱的问题如果你希望获得高纯度的目的蛋白,而不考虑非特异性结合的话,你可以将抗体和蛋白样品在加入 Protein A/G-argarose 微球之前进行混合, 这样最后抗体也会和目的蛋白一同被洗脱下来,从而可能会对 western blot 检测造成干扰44. Note: This Co-IP protocol is to bind antibody to the Protein A/G-argarose beads and then mix with the antigen. It gives lesser yield than the other one and avoids the problem of co-elution of antibodies. If you want to yield high purity of参考资料:1.1.Immunoprecipitation-wikipedia;2.2.Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Background&Protocol;target protein regardless of non-specific binding, you can mix antibody with protein sample prior to addition of Protein A/G-agarose beads, thus in the end the antibodies are also co-eluted with target protein and interference might occurs in western blot detection. [2]。