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1、 解偶联蛋白2在PM2.5致心肌细胞损伤中作用机制的初步探讨 郑贵浪吴家兴摘要 目的 初步探讨解偶联蛋白2（UCP2）在PM2.5致心肌细胞损伤中的作用。 方法 培养大鼠心肌细胞株H9C2细胞，给予siRNA和（或）PM2.5刺激，48h后检查肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH），RT-PCR及Western Blot检测UCP2基因转录及蛋白水平，比色法检测线粒体的活性氧（ROS）和ATP酶的活性。 结果 与PM2.5组相比，PM2.5+siRNA组心肌细胞CK和LDH明显升高（96921 vs 74729U/mL，107159 vs 87747U/L），ATP酶活性下降明显（24.74.
2、7 vs 40.24.9U/mgprot），细胞内ROS明显增多（90.26.2 vs 69.26.3U/Well），差异均有统计学意义（P关键词 解偶联蛋白2；PM2.5；H9C2；心肌细胞；线粒体；活性氧；ATP R730.2 A 2095-0616（2015）01-40-05Abstract Objective To investigate the effect of UCP2 during the injury procedure of PM2.5 on the rat myocardial cells H9C2. Methods Rat cardiomyocytes H9C2 cel
3、l lines were cultured， after 48 hours of given PM2.5 and （or） siRNA stimulus， creatine kinase （CK） and lactate dehydrogenase （LDH） were detected. The expession of UCP2 in transcription and translation levels was detected by RT-PCR and Western Blot respectively. Mitochondrial reactive oxygen species
4、（ROS） and ATP enzyme activity were determinated by colorimetric detection. Results Compared with the PM2.5 group， CK and LDH were elevated （96921 vs 74729 U/mL，107159 vs 87747 U/L）， ATP activity decreased （24.74.7 vs 40.24.9 U/mgprot）， intracellular ROS increased （90.26.2 vs 69.26.3 U/Well） in the P
5、M2.5+siRNA group. And the differences were statistically significant （P0.05）. Conclusion PM2.5 can lead to myocardial cell damage and increased expression of UCP2 gene， and the silence of UCP2 by RNAi lead to aggravating injury of H9C2 cells， indicating that UCP2 may play an protective effect during
6、 the injury procedure of H9C2 caused by PM2.5.Key words UCP2； PM2.5； H9C2； Myocardial cells； Mitochondria； ROS； ATP近年来，大气污染备受关注，其中颗粒物是城市大气污染的重要物质。根据粒径大小可将其分为空气动力学直径介于2.510m粗颗粒物（PM10）和空气动力学直径小于2.5m的细颗粒物（PM2.5）。PM2.5与人体健康关系最密切。PM2.5化学成分复杂，包括无机成分、有机成分、微量重金属元素、元素碳等，主要来自于人类活动如工业生产及交通运输工具尾气排放、工业生产及取暖的燃烧释放
7、、吸烟的烟雾释放等1。动物试验及临床流行病学调查显示，PM2.5与人类心血管疾病有密切关系。PM2.5可促进心肌细胞变性和间质细胞增生，进而导致以心肌间质纤维化为主要表现的心肌重构2-3；可以通过氧化应激反应损伤血管黏膜，引起血管通透性及血液黏度增加，加速主动脉和冠状动脉粥样硬化和斑块破裂过程4-5；可以诱发心律失常、心肌缺血甚至心跳聚停等6-7。我们前期研究也表明，PM2.5可以导致H9C2心肌细胞线粒体损伤，导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生过多，ATP合成减少，线粒体膜电位损害。解偶联蛋白（uncoupling proteins，UCPs）是线粒体内
8、膜上能够通过转运H+降低线粒体膜电位蛋白家族，与细胞内的ATP及ROS有着密切的关系8-9。在5种同类物中，UCP2分布最广泛，体内和体外的研究发现，UCP2可以通过降低膜电位，减少ROS产生进而保护神经细胞组织10。然而，UCP2在PM2.5导致的心肌细胞损伤过程中作用如何？目前研究甚少。本课题拟通过RNA干扰技术，沉默H9C2心肌细胞的UCP2表达，检测PM2.5毒染心肌细胞的ROS、ATP改变及心肌细胞损伤指标，初步探讨UCP2在PM2.5导致的心肌细胞损伤过程中的作用。 1 材料与方法1.1 RNA干扰片段由上海吉凯基因公司合成2条RNA干扰片段和1条阴性对照RNA干扰片段，分别为si
9、RNA1，siRNA2和ncRNA。siRNA1序列为：上游，5-GCA CUG UCG AAG CCU ACA A dTdT -3；下游，5-UUG UAG GCU UCG ACA GUG C dTdT -3。siRNA2 序列为：上游，5- CCU CAU GAC AGA CGA CCU C dTdT -3；下游，5- GAG GUC GUC UGU CAU GAG G dTdT -3。ncRNA序列为：上游，5- UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT -3；下游，5- ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT -3。1.2 siRNA转染步骤（1）转染前1
10、d，5104H9C2细胞接种在24孔板上，0.5mL完全培养基，转染前细胞汇合达到70% 80%；（2）在50L无血清培养基加入2L的siRNA，柔和混匀；（3）混匀lipofectamine试剂，用50L无血清培养基稀释1L的lipofectamine试剂，轻轻混匀，室温放置5min；（4）将稀释好的siRNA和lipofectamine试剂混合，轻柔混匀，室温放置20min，以便形成siRNA-ipofectamine复合物；（5）将100L的siRNA-ipofectamine复合物加到含400L完全培养基的细胞孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板；（6）细胞在37，5%CO2培养箱中，培养24
11、h，检测转染后UCP2的表达情况。用siRNA-CY3（广州瑞博公司）转染，通过荧光显微镜进行效率验证，计算转染效率。本实验转染效率达到80%左右，说明该转染步骤是可行的。1.3 预实验筛选UCP2基因有效的干扰片段：将H9C2细胞随机分成5组，即control组，lipo组，siRNA1组，siRNA2组，ncRNA组，分别给予同体积培养基、lipofectamine、siRNA1、siRNA2和ncRNA刺激，转染步骤同1.2；转染后48h检测UCP2转录水平表达，步骤同1.4。1.4 RT-PCR检测UCP2基因表达用TRIzol法提取H9C2细胞的总RNA，然后逆转录成cDNA，再以c
12、DNA为模板进行扩增。根据读取的CT值对基因进行相对定量。RT-PCR反应体系为：forward/reverse引物各0.25?L，SYBP Green PCR master mix 5?L，cDNA模板4L。PCR进行45个循环，条件为：95，5min，95，15s，60 30s。UCP2引物为：5- GGG CAC CTG TGG TGC TAC CTG-3（sense），5-ATG AGC TTT GCC TCC GTC CGC-3（antisense）；看家基因18s-RNA引物为：5-CCA TCC AAT CGG TAG TAG C -3（sense），5-GTA ATG GCG
13、GGT CAT AAG-3（antisense）。1.5 Western Blot检测UCP2蛋白表达用2SDS裂解细胞，12000g/min 离心5min，提取总蛋白，然后用BCA法迅速进行蛋白浓度定量。提取的总蛋白，加入2SDS蛋白上样缓冲液（按11的比例），100煮沸5min，-20保存备用。配置10% SDS-PAGE分离胶，5%的浓缩胶，微量进样器吸取30?g样品缓慢加入样品孔中，用100V进行浓缩胶电泳20min，140V在分离胶中电泳40min。然后转膜、封闭，加入一抗（proteintech 公司，货号：11081-1-AP） 4过夜，PBST洗膜，加入二抗37反应1h，用化学
14、发光法（ECL）显影。1.6 PM2.5的采样及其配制选取湛江市区汽车流量大、污染较重的地区为采样点。用PM2.5采样仪采集PM2.5，超声震荡，洗脱颗粒物，冷冻真空干燥成干粉，-20保存备用。配制：称取一定量PM2.5干粉，经紫外线照射后加入培养基溶液混匀，配制成终浓度为10，50，100g/mL的溶液进行预实验。根据预实验结果，本实验选用50g/mL作为细胞毒染剂量。1.7 H9C2细胞处理及分组H9C2细胞株购自中国科学院典型培养物保存委员会细胞库，用10%小牛血清培养液，在37培养箱静置培养；13d更换一次培养液。PBS轻柔冲洗，适量0.25%胰酶溶液消化等常规操作，进行传代及实验。当
15、细胞生长至70%左右密度时，将细胞随机分成三组，分别为NC组，PM2.5组及PM2.5+siRNA组，每组3个样本。三组细胞分别给予常规的培养基，50g/mL的PM2.5培养基，含PM2.5（50g/mL）与siRNA（80nmol/L）的培养基刺激。48h后检测相关指标。1.8 肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）、ROS、线粒体ATP酶活力检测（1）H9C2细胞受刺激后48h，收集细胞培养基上清液，按照试剂盒说明采用比色法进行检测CK和LDH浓度。乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（比色法），货号A020-1；肌酸激酶（CK）测定试剂盒（比色法），货号A032；试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
16、（2）按照活性氧检测试剂盒进行操作，购自碧云天，货号S0033。简要步骤为：各组细胞经过处理后，按照试剂说明用11000无血清培养液稀释DCFH-DA。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。37细胞培养箱内孵育20min，然后用无血清细胞培养液洗涤细胞3次。用荧光分光光度计检测12，激发波长488nm和535nm。 （3）ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷，测定无机磷的量可判断ATP酶活力的高低。按照试剂盒采用比色法检测ATP酶活力（购自南京建成生物工程研究所，试剂盒货号：A016-1）。1.9 统计学处理所有计量资料均以（）表示，并采用SPSS18.0统计软件进行统计分析。方差齐时，采用单因素方差分析进行统计，两组间比较采用LSD法分析，P
