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1、列出儿种常用的血清学检测技术1. 植物病原细菌鉴定的主要有哪几方面的依据2. 植物病毒病的鉴定是否需要遵循科赫尔法则？如何获得生物分离物3. 简要介绍气流传播的真菌病害常用的接种方法有哪些4. 请叙述5种以上基于PCR原理的延伸技术巢式PCR 是一种变异的聚合酶链反应(PCR),使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整 的片段。第一-对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物(因为他们 在笫一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段 短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在 错误片段上进行引物配对并扩增
2、的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异反转录PCR (Reverse Reaction, RT-PCR) 乂称为逆转录PCR。其原理是：提取组织或 细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反 转录成cDNAo多重PCR 一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段, 主要用于单一致病因了等的鉴定多重PCR(multiplex PCR),又称多重引物PCR或复合PCR, 它是在同一 PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增岀多个核酸片段的PCR反应，其 反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同重组PCR将两个不相邻的DNA片段
3、重 组在一起的PCR称为重组PCR。其基木原理是将突变碱基、插入或缺失片段、或一种物质 的几个基因片段设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物示，将产物混合，再用 一对引物对其进行PCR扩增。所得到的产物是一重纽.合的DNAo锚定PCR川于扩增已知 一端序列的目的DNAo在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已 知的序列作为引物进行PCR扩增。锚定PCR (Anchored PCR, A-PCR)主要用于分析具 有可变末端的DNA序列，Loh等用A-PCR对人外周血淋巴细胞T细胞受体a 链的mRNA 的多变性进行了分析。13. 叙述分了生物学的中心法则并给岀图示中心法
4、则(genetic central dogma),是指遗传信息从DNA传递给RNA,再从RNA传递给 蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过稈。也可以从DNA传递给DNA,即完成DNA 的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。eif14.植物细菌病害的症状有何特点、症状：细菌病害症状主要有：腐烂。由于细菌分泌的果胶酶的分解作用而使受害植物的根、 茎、块根、块茎、果实、穂等肥厚多汁器官的细胞解离、组织崩溃腐烂，如白菜软腐病。 坏死。主要发生在叶片和茎杆上出现各种不同的斑点或枯焦，前者如棉花角斑病，后者如水 稻白叶枯病。萎蔦。因细菌寄生在维管束内堵塞导管或因细菌毒素而引起，如青枯病。 肿
5、瘤。由于细菌刺激，使寄主细胞增生、组织膨大而形成，如癌肿病。黄化矮缩。在木质 部寄生的细菌使植株表现黄化、萎缩，如術萄皮尔氏病、杏叶焦病、苜蓿矮化病、tr蔗矮化 病和桃幼果病等。15. 如何区分植物病毒病与其他病害受害植物常表现如下症状：变色。由于营养物质被病毒利用，或病毒造成维管束坏死阻碍 了营养物质的运输，叶片的叶绿素形成受阻或积聚，从而产生花叶、斑点、环斑、脉带和黄 化等；花朵的花青索也可因而改变，使花色变成绿色或杂色等，常见的症状为深绿与浅绿相间 的花叶症如烟草花叶病。坏死。由于植物对病毒的过敏性反应等可导致细胞或组织死亡, 变成枯黄至褐色，有时出现凹陷。在叶片上常呈现坏死斑、坏死环和
6、脉坏死，在茎、果实和 根的表面常出现坏死条等。畸形。由于植物正常的新陈代谢受干扰，体内生长素和其他激 素的生成和植株正常的生长发冇发生变化，可导致器官变形，如茎间缩短，植株矮化，生长 点异常分化形成丛枝或丛簇，叶片的局部细胞变形出现疱斑、卷曲、蕨叶及黄化等。16. 真菌菌种保存的基木原理是什么？简要介绍几种常用的菌种保存方法。 基木原理微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃 或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因索，所以，菌种保藏方法虽多, 但都是根据这三个因素而设计的。保藏方
7、法大致可分为以下几种：1 传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用）, 培养后于46C冰箱内保存。2. 液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养 物和穿刺培养物上血覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分熬发而引起菌种死 亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。3. 载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙了、硅胶、滤纸上，而后进行干 燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。4. 寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋 体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚
8、内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培 养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。5冷冻保藏法 可分低温冰箱（-2030C，-5080C）.干冰洒精快速冻结（约-70C ） 和液氮（196C）等保藏法。6冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70C左右）下快速冷冻，然后在减压下利用 升华现象除去水分（真空干燥）。有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使川保护剂来制备细胞悬 液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离了键对水和细胞 所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘汕、二甲亚砚等。分子生物
9、学1. 减轻核酸破坏：简化步骤，缩短时间，减轻侑害因素对完整性的破坏DNA酶的 激活需要Mg2+, Ca2+等二价金属离了，使用EDTA,柠檬酸盐并在低温条件下操作，基木 上可抑制DNA酶活性RNA酶广泛存在与不易失活决定了生物降解是RNA提取过程主要 危害因素。2. CTAB法原理：组织大部分是核DNA,和组蛋白、非组蛋白结合，以核蛋白形式存在于 细胞核。CTAB是阳离了去污剂,可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶，当降低 浓度到一定程度从溶液中沉淀,离心可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类分开，然后将 CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTA
10、B能溶解于乙 醉中。3. CTAB法注意问题：DNA二级结构和双链易受多种因素影响引起双链解开，抽提时 避免使用变性条件.抑制内外源DNase的活力（低温操作；调节pH ,使偏碱；抽提液中加 表面活性剂；加螯合剂（EDTA）除去酶的铺助因了（Mg2+）,使酶活性丧失）防止化学降解. 如过酸或过碱,pH8.0左右为宜.防止物理因素降解.操作过程要尽量简便、温和、减少搅 拌次数，不要剧烈摇动.植物次生代谢物有干扰作用.尽可能选幼嫩、代谢旺盛新生组织为 材料，次生代谢物较少,DNA含量高，且易于破碎4. 蛋白质：沉淀、电泳、透析、层析（离了交换层析、分了筛、亲和层析）、超速离心5. 重DNA技术：人
11、类根据需要选择目的基因在体外与基因载体重组，转移至另一细 胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。核心要素：质粒、限制 性内切酶、修饰酶、PCR6质粒载体：在天然质粒基础上为适应实验室操作而进行人工构建。通常带有一个或一 个以上选择性标记基因和一个人T合成含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列， 并去掉了大部分非必需序列，使分了量尽可能减少，以便于基因工程操作。7. 理想克隆载体特性：分了量小、多拷贝、松弛控制型；具有多种常用的限制性 内切酶的单切点；能插入较大的外源DNA片段；具有两个以上的遗传标记物，便于鉴 定和筛选。对宿主细胞无害。8. PCR （变性退火“延伸
12、）：模板DNA的变性：95C模板DNA与引物的退火（复 性）：50-55C左右引物的延伸。一个循环需24分钟9. PCR技术延伸：巢式、反转录（RT-PCR）、多重、重组、锚定、不对称、反向、免疫、 原位、定量、荧光定量（Q-PCR）PCR.10. 体外转录：通常转录发生在生物体内，在体外无细胞系统中含有RNA转录酶、NTP 等条件，用DNA作为模板，模仿体内转录过程生成RNAo （启动子T7、Sp6、T3）11. RNA干扰（RNAi）:在各类生物中，双链RNA （dsRNA）诱导产生特异性基因沉 默的机制。12. 第一代基因沉默载体：构建反义RNA载体、构建hpRNA的载体、病毒诱导的基因
13、 沉默（VIGS）载体。第二代基因沉默载体：人TmicroRNA技术、人工tasiRNA技术。13. Southern blot:般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶 上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他I古I相支持物上，经干烤或者 紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射白显影或酶反应显色，从而 检测特定DNA分子的含量。14. 蛋白质三维结构预测：同源建模法：基于序列同源比对，对于序列相似度30% 的序列模拟比较有效，最常川串线法/折吾识别法：适于对蛋白质核心结构进行预测，计 算量大从头预测法：基于分了动力学，寻找能量最低的构彖，
14、计算量大，只能做小分了预 测真菌1 培养基类型-天然：纟R成复杂，无法了解成分；大多真菌生长良好，易产抱半组 合：适宜大多真菌分离、培养和一般性研究纟R合：研究微生物的生理、生化特点2. 灭菌和消毒方法热力灭菌（干热灭菌-160-170C,2-3h/il热灭菌：包括巴氏灭菌- 短时、中高温，间歇火菌常压火菌，高压蒸汽火菌-121C,2030 min,靠蒸汽的高温而不 是压力。效率远高于干热灭菌；适用多种材料）过滤灭菌辐射消毒法（紫外辐射灭菌： 240-280,253,穿透力较差，适用于小范用空气灭菌；电离辐射：Y 射线、x射线等，一般不用于实验室。）3. 消毒：用物理或化学方法杀死物体上的大部
15、分微生物，以防侵染；不能消火所有的微 生物。灭菌：用物理或化学方法完全除去或杀灭器物表面和内部的一切微生物。区别：灭菌常采用物理方法，消毒多采用化学方法；灭菌结果是物品上没有一个活的微 生物存在，物品处于无菌状态，消毒后物品处于有菌状态4. 常规表面消毒:70%酒精浸十儿秒-0.1 %升汞溶液浸l2min无菌水冲洗23次5. 土壤中特定植物病原真菌的分离:十壤稀释法分离植物病原真菌诱饵法埋管法 -分离十壤习居菌过筛法-分离菌核6. 菌种保存的原理：采用低温、冷冻或缺氧等方法，中止病原真菌的生长和繁殖，降低 代谢强度，使之处于休眠或假死状态。斜面室温保存法（方便、易操作;菌种易干燥、失活） 斜血
16、低温保存法（方便、易操作;菌种易失活）矿物油保存法：常用液体石蜡灭菌水保存 （方便;适用于很多真菌;可保存多年，菌种不易退化和变异）冷冻干燥保存-适于保存大多数 产砲真菌，效果很好；不适川鞭毛菌或只产生菌丝体的真菌其它土壤中保存、干燥保存7. 病原真菌致病性育接鉴定法直观，结果较准确、可靠；工作量大，不适于初选 间接鉴定法快速；一次可处理大量样品；适宜于大量菌株的初选；可靠性稍差&土传病害接种方法-土壤接种法接种时由于加入大量有机质，影响结果。可直接把 病原菌液体培养，然后把菌丝体拌入土壤蘸根接种法适宜许多根茎部侵染的病害;避免十 壤接种的缺点根部切伤接种法嵌入法接种茎部病害接种9. 气流和南
