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1、液相色谱检测1 仪器的基本常识及术语1.1 仪器结构： 液相色谱仪主要包括泵，进样器，色谱柱，检测器.1.2 仪器分类： 液相色谱仪属于精密仪器中的色谱仪器.依据分为离机制,吸附，支配，离子交换，亲和色谱,体积排阻色谱. 依据流淌相与固定相的极性,分为正相色谱法和反相色谱法.1.2.2高效液相色谱法的应用围：高效液相色谱法适用于高沸点不易挥发，受热不稳固易分解，分子量大的,不同极性的有机化合物,生物活性物质和多种自然产物,合成的和自然的高分子化合物等.1.3 仪器检定： 液相色谱仪检定周期为 1年, 在两次检定间期进行一次期间核查,也可以依据情形增加核查次数.1.4 爱惜保养： 对于液相爱惜方
2、式主要是周爱惜和日爱惜,其中周维护包括联机系统及中工作站软件爱惜，数据库整理备份， 检测器自检，爱惜单向阀，溶剂砂芯滤头，进样器，电机泵检查爱惜，溶剂瓶清洗等.日爱惜包括环境温度，环境湿度，色谱柱温度，压力流速，进样口是否干净，进液处的砂芯过滤头是否干净，流淌相交换时是否有沉淀.1.5 色谱法的常用基本术语基线：在色谱操作条件下 ,没有被测组分通过鉴定器时,记录器所记录的检测器噪声随时间变化图线称为基线.死时间 ,保留时间及校正保留时间:从进样到惰性气体峰显现极大值的可编辑资料 - - - 欢迎下载时间称为死时间 ,以td 表示.从进样到显现色谱峰最高值所需的时间称保留时间 ,以tr表示.保留
3、时间与死时间之差称校正保留时间.以Vd 表示.死体积 ,保留体积与校正保留体积:死时间与载气平均流速的乘积称为 死体积 ,以Vd表示 ,载气平均流速以 Fc表示 ,Vd=tdxFc. 保留时间与载气平均流速的乘积称保留体积,以Vr表示,Vr=trxFc峰面积： 流出曲线 色谱峰 与基线构成之面积称峰面积,用A表示 . 拖尾因子： 是反映峰对称性的指标,运算公式：拖尾因子T W0.05h/2d1 （其中 W0.05h 为5%峰高处的峰宽, d1为峰顶点至峰前沿之间的距离） .峰高与半峰宽 :由色谱峰的浓度极大点向时间座标引垂线与基线相交点间的高度称为峰高 ,一般以 h 表示 .色谱峰高一半处的宽
4、为半峰宽,一般以 x1/2 表示.1.7 色谱检测的特性（1） ）灵敏度高.（2） ）线性围宽.（3） ）分别度与柱效，选择因子，容量因子，分析时间的关系：（4） ）分别度与柱效的平方根成正比,选择因子确定时,增加柱效.（ 5）支配系数与支配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数,随分别柱温度，柱压的转变而变化：一般通过转变固定相和流淌相的性质和组成或降低柱温,可增大选择因子.（ 6）增大选择因子的最有效方法是选择合适的固定液. 对于液相色谱,转变流淌相的组成,可以有效把握 k.可编辑资料 - - - 欢迎下载2 仪器的操作规程2.1 日立液相设备L-2000/2400 操作规 程2.1.
5、1 使用环境环境温度： 4 55 . 相对湿度：小于 95%RH.2.1.2 使用前预备检查所用溶液 如流淌相,乙腈等 是否足够.检查线路是否连接正常.2.1.3 设备操作方法详细操作如下：(1) 依次开启泵开关,检测器开关,自动进样器开关, 柱温箱开关.(2) 打开软件,点击“ i”按钮,显现联机界面,点击“Iinitialize ”ini .laiz按钮,当文本框显现文字时,表示联机成功. 3检查所用方法是否符合要求.如不符合,进行设置. 4开泵.检测详细操作如下：(1) 建立所需样品盒.(2) 点击检测按钮,选择刚建立的样品盒. 3第一进行走基线.(4) 当基线走平常,点击系列样品检测按
6、钮,进行标样, 样品检测.可编辑资料 - - - 欢迎下载(5) 当标样检测结果出来时,打开结果窗口,选择所需标样结果,点击“ Recalculateri:k . lkjuleit进行重新运算,然后点击“ Calibration ” k. librei .n 进行定标. 6当样品结果出来时,打开结果窗口,选择所需样品结果,点击“Recalculate ”ri:k . lkjuleit进行重新运算,然后点击“ModifyReport ”m .difai, rip .:t,显现结果报告,即可查看样品详细结果.2.1.4 更换流淌相 详细操作如下：(1) 当流淌相快不够时或反常时,准时更换流淌相.
7、2先把泵关闭,将流淌相入口放入新流淌相中.(3) 将泵阀逆时针旋转,进行排气.大约3分钟后,关闭排气功能.(4) 排气完毕后,将泵阀顺时针旋转拧紧,开泵. 5走基线,当基线走平常,开头做标样,做样.2.1.5 关机详细操作如下：(1) 先把泵关闭,将流淌相入口更换为超纯水.(2) 将泵阀逆时针旋转,进行排气.大约3分钟后,关闭排气功能.(3) 排气完毕后,将泵阀顺时针旋转拧紧,开泵.可编辑资料 - - - 欢迎下载(4) 用超纯水冲洗管路大约 20分钟.(5) 把泵关闭,将超纯水更换为100%甲醇或 100%乙腈. 6将泵阀逆时针旋转,进行排气.大约3分钟后,关闭排气功能.(7) 排气完毕后,
8、将泵阀顺时针旋转拧紧,开泵.(8) 用100%甲醇或 100%乙腈冲洗管路大约 30分钟. 9关泵,关液相软件,关泵开关,检测器开关,自动进样器开关,柱温箱开关.2.1.6 爱惜保养，留意事项(1) 进行旬爱惜检查工作,主要检查事项：软件是否正常，温度，清洗，进样器，泵单元.(2) 每次测量前进行标样检测, 斜率达到 99.99%要求才能检测样品, 测完样品准时清理.(3) 按要求进行每天 2个小时以上的清洗.2.2 Waters 高效液相色谱 -2695/24892.2.1 开机自检详细操作如下：(1) 打开 Alliance .lai.ns 2695 和2489 的电源开关至ON 1的位置
9、,仪器开头进行自检.(2) 仪器将进行大约5分钟的自检过程,待仪器自我测试完毕后,显现以下画面,画面上方的状态显示区会显现“Idle ” aidl 状态,表示开机测试正常.2.2.2 流淌相有机溶剂要求用色谱纯 进口名牌最好 ,水或缓冲盐溶液要用超纯水电阻率： 18.2M ,每48小时制备新颖的水相流淌相,特别是 100% 含水流淌相使用时间不超过两天.可编辑资料 - - - 欢迎下载6根管子都在液面以下.溶剂的位置必需高于溶剂混合阀Gradient Proportioning Valve.greidi .ntpr .p.:.ni.v. lv清洗柱塞密封垫 Seal Wash si:l w.的
10、溶液： 含5% 10%甲醇的超纯水.洗针液 Needle Wash ni:d .l w .： 50%甲醇： 50%水该比例仅适用于反相试验 .注: 以上溶剂或溶液均需用 0.45m的膜过滤并超声脱气 1分钟,用干净的玻璃容器盛放 ,防止污染,同时玻璃容器应用超纯水来清洗而不能用自来水.2.2.3 灌注柱塞密封清洗清洗操作步骤：(1) 回到 Menu menju:画面,选择 Diag .(2) 确定 Seal Washsi:l w.的管路放在正确的位置.(3) 按Prime Seal Wash praim si:l w . ,再按 Start,直到清洗溶剂流出泵杆密封圈冲洗废液管,按Halt .
11、 h.:lt(4) 按Close.留意：密封圈清洗 Seal wash si:l w .溶剂,在反相液相色谱中可使 用 Water/MeOH methylalcohol甲 醇 =90/10或 Water/Acetonitrile . sit.unaitril 乙腈 =95/5 依据实际需要使用不同溶剂.2.2.4 灌注针头清洗操作步骤： 回到 Main mein 的画面, 选择Diag ,选择 Prime praim Ndl Wash.设定值为 30 秒,如想要多清洗几次时,请按Start Again .清洗溶剂： 50%的甲醇溶液留意：如上述清洗溶剂无法防止进样时的交叉污染,使用较强的溶剂系
12、统来进行清洗操作.2.2.5 打开真空脱气机如液相仪管路干,可进行使用,如管路不干就依据以下步骤进行操作：按“Menu/Status ”steit . s键,进入 Status 1 画面.利用方向键将光标移至“ Degasser ”di:g . s.位置,按 Enter .利用上下键选择模式为ON .留意：在开启除气装置时,要确认全部溶剂管路都布满溶剂.如可编辑资料 - - - 欢迎下载没有溶剂时请执行溶剂的Dry Prime drai praim 操作.2.2.6 执行干灌注确定流淌相溶剂的管子放在正确的位置,检测器 Detector ditekt . 废液管及定量环 Sample Loop
13、 lu:p 的废液管是否放置于适当的废液容器中.摇动溶剂瓶的过滤器 Solvent Filter s.lv.nt filt .,防止气泡附着在过滤器的外表面.将空的针筒插入抽液阀 Prime/Ventvalue 中,以逆时针的方向旋转3圈.按 “Menu/Status” steit .s 键 , 进 入 Status1 画 面 , 按 “Direct Function ”direkt f . k.n功能键,选择 Dry Prime ,按Enter.按下面使用的溶剂开启阀门例如 :Open A ,然后将针筒向外拉, 抽 出 5 10mL 溶 剂 并 完 全 抽 出 溶 剂 管 子 的 气 泡 ,
14、 完 成 后 关 闭Prime/Vent 阀门.在“Enter a duration ”djurei .n中输入 3分钟,按“Continue ”键,泵即以 3.0mL/min 的流速进行清洗 Purge .可重复上两个步骤,将所要使用的流淌相溶剂Dry Prime .2.2.7 执行湿灌注按“Menu/Status ”键,进入Status1画面,利用方向键将光标移至 “Composition ”k.mp .zi.n字段,将欲 Wet Prime的溶剂输入 100%.按“DirectFunction ”direktf . k.n功能键,选择 WetPrime ,按Enter .WetPrime 的 原 设 定 值 , 一 般 为 FlowRate:7.5mL/min , Time: 3.0min ,然后按下“OK”键,泵即开头进行 Wet Prime 操作.重复上述的步骤直到全部溶剂Wet Prime 进行完毕.2.2.8 设定流淌相平稳色谱柱按“Menu/Status ”键,进入 Status 1画面,利用方向键将光标移至“Composition ”k.mp .zi.n字段,利用
