基于CRISPR/Cas9研究LIPG/rs9958734逆转卵巢癌多药耐药的机制第一章生物信息学筛选卵巢癌多药耐药相关的单核昔酸多态性目的:采用生 物信息学的方法筛选卵巢癌多药耐药相关的单核昔酸多态性方法:利用GEO数 据库卵巢癌顺钳耐药芯片(GSE45553)和多药耐药芯片(GSE73935)分别寻找卵巢 癌顺钳耐药和多药耐药的关键生物学通路再利用TCGA数据库下载卵巢癌突变 数据,dbSNP数据库注释和SNPs多药耐药差异分析,SNPs靶基因PPI蛋白互作网 络分析和SNPs功能预测,发现与卵巢癌多药耐药相关的功能SNPso结果:癌症中的蛋白多糖,MAPK,粘着斑,PI3K-AKT等通路与卵巢癌顺钳耐药 有关,其中 EGFR, ITGA5, ERBB3, LAMA1, LAMB3, TGFB2, NFKB2 等基因表达下 调,BRCA1, TIMP3, CYFIP2, ANK3, MEF2C等基因表达上调质膜(质膜蛋白,质膜整 合蛋白)和代谢(蛋白代谢,细胞代谢)通路与乱卵巢癌多药耐药有关在紫杉醇耐 药细胞系中,观察到ABCB1, EPHA7和RUNDC3B基因的上调表 达,LIPG, MCTP1, NSBP1, PCDH9, PTPRK 和 SEMA3A 基因的下调表达。
在多柔比星耐药细胞系中,ABCB1,ABCB4和IFI16基因的上调表达TCGA筛 选了 70个SNPs, SNPs目的基因的PPI蛋白网络分析显示LDH1A2, P0LR2H, TRIM4, CDC20, VPRBP, CETN2, HSPA8, UGHG1, DDB1 和 PI4KA 等显著 突变基因与卵巢癌多药耐药有关,TCGA预后分析观察到ALDH1A2 (p=0. Oil), CETN2 (p=0. 027), ERBB2 (p=0. 019), TRIM4 (p=0. 019)与总生存 有关,UGHG1 (p=0. 023)与无瘤生存有关SNPs基于亚洲人群GWAS的功能预测显 示出5个SNPs,即IGHGl/rs1042782(C>T), 0RM2/rs2636890(G>A), P0U6F2/rs7786697 (T> C), LIPG/rs9958734(T> C)和 CENT2/rs230U8 (C> A),但结果不理想需通过后续对显著突变基因和SNPs的连锁不平衡分析或生物学实验进行功 能的预测和验证结论:代谢通路在卵巢癌多药耐药中扮演着重要角 色,LDH1A2, P0LR2H, TRIM4, CDC20, VPRBP, CETN2, HSPA& UGHG1, DDB1 和 PI4KA 等显 著突变基因,以及5个位点IGHGl/rs1042782(C>T), 0RM2/rs2636890(G>A), P0U6F2/rs7786697(T> C), LIPG/rs9958734(T>C)和 CENT2/rs230U8 (C> A)与卵巢癌多药耐药相 关。
第二章应用RGS双荧光载体对LIPG/rs9958734&VPS13A/rs7034531进行碱基 置换目的:spCas9-NG和x Cas9 (3. 7)在RGS双荧光替代性报告载体引导下对靶位 点LIPG/rs9958734和VPS13A/rs7034531在HEK 293T细胞系中编辑效率分析, 实现对后期A2780细胞系靶位点的高效突变,得到A2780突变株方便后续实验方法:使用罗氏转染试剂按h Cas9:lgRNA:reporter=l :l:0. 5将RGS双荧光 替代性报告载体分别与sp Cas9-NG和x Cas9 (3. 7)组合转染至HEK293T细胞 系,48h后荧光显微镜拍照和流式上机分析转染效率再将最高效率的组合转染 至A2780细胞系并进行单克隆培养,最后PCR测序鉴定单克隆细胞系结 果:LIPG/rs9958734在spCas9-NG和x Cas9 (3. 7)组合中的编辑效果较 高,VPS13A/rs7034531在sp Cas9-NG和x Cas9 (3. 7)组合中的编辑效果较低sp Cas9-NG+lg LIPG-l+RGS+e GFP组合的编辑效果可最高达53. 3%,而x Cas9(3. 7)+sg VPS13A-l+RGS+e GFP 组合的编辑效率较 sp Cas9-NG+g VPSl-3A+RGS+e GFP组合高,但最高仅达15. 9%。
x Cas9 (3. 7)的编辑效率高于sp Cas9-NG,尤其体现出对非经典PAM ACG, GCG和TTG的高效剪切将sp Cas9-NG+lgLIPG-l+RGS+e GFP 和 x Cas9 (3. 7)+sg VPS13AT+RGS+e GFP 分别转染至 A2780 细胞系,PCR测序鉴定LIPG突变成功且效率达25%, VPS13A突变失败结论:Cas9的变体sp Cas9-NG和x Cas9 (3. 7)具有高效碱基置换功能,但x Cas9 (3. 7)对非经典PAM的编辑效率高于sp Cas9-NGA2780细胞系 LIPG/rs9958734(CC-TT)成功获得突变(A2780 KI细胞株)第三章LIPG和 VPS13A 与凋亡通路的 Bax、Bcl2、Caspase-3、Caspase-8、PARP-1 表达量的相 关性分析目的:研究A2780和A2780 DDP细胞系顺钳干预后LIPG和VPS13A与凋 亡通路关键基因 Bax、Bcl2、Caspase-3、Caspase-8、PARP-1 基因的 mRNA 和蛋 白表达量的关系,分析LIPG和VPS13A是否参与顺钳诱导凋亡通路。
方法:A2780 和 A2780 DDP 细胞系分别在 0 u g/mL, 1 u g/mL, 2 u g/mL, 4 u g/m L 和0 u g/m L, 3 u g/m L, 6 u g/m L, 12 u g/m L的顺钳浓度干预48h后,应用 Real-time RCR 和 ffestern-blot 对 LIPG、 VPS13A、 Bax、 Bcl2、 Caspase-3、 Caspase-8和PARP-1的m RNA和蛋白表达量进行检测分析结果:在A2780细胞 系中,顺钳处理48h后LIPG mRNA表达量分别为1. 00±0. 11, 2. 47±0. 27, 3. 53± 0.20和2. 04±0, 11,差异具有统计学意义(p<0. 05) o在A2780 DDP细胞系 中,LIPG基因的m RNA表达量随着顺钳浓度递增而增多,分别为1. 00±0. 06, 7. 28 ±0. 45, 7. 47±0. 36 和 9. 22±0, 3&与 Caspase-3, Bax 和 PRAP-1 基因的 m RNA 表达量相关在A2780和A2780DDP细胞系中VPS13A基因的m RNA表达量与顺钳干预浓度 没有统计学意义。
在A2780和A2780DDP细胞系中,顺钳处理48h后LIPG和VPS13A 基因的蛋白表达量随着顺钳梯度而明显改变但是当顺钳浓度分别为4 ug/m L 和6 u g/m L时,LIPG和VPS13A基因的蛋白表达量下降LIPG和VPS13A基因的蛋白表达量与Bax, Caspase-3基因的蛋白表达量相关 相较与A2780细胞系,LIPG的m RNA和蛋白表达量在A2780 DDP细胞系中明显增 加,差异具有统计学意义(p< 0. 05);而VPS13A的蛋白表达量在A2780 DDP细胞 系中明显增加,差异具有统计学意义(p<0. 05)结论:LIPG作为脂质代谢基因 参与顺钳诱导凋亡通路同样.VPS13A编码的Chorein蛋白作为抗凋亡因子与卵巢癌顺钳耐药有关 第四章LIPG/rs9958734(T>C)突变型通过诱导S期阻滞和凋亡协同抑制卵巢 癌细胞的增殖,迁移,侵袭和逆转多药耐药目的:研究A2780 KI细胞系 (LIPG/rs9958734-野生型 TT)和 A2780 细胞系(LIPG/rs9958734-突变型 CC)在顺 钳干预后的肿瘤生物学行为上的差异,寻找LIPG/rs9958734逆转卵巢癌多药耐 药机制。
方法:采用CCK8法,Transwell法,划痕法,Annex in-V-7-ADD双染色法,PI 染色法分别对A2780 KI细胞系(LIPG/rs9958734-野生型TT)和A2780 (LIPG/rs9958734-突变型 CC)细胞系进行 0 u g/m L, 1 u g/m L, 2 u g/m L 和 4 U g/m L浓度的顺钳干预下的细胞增殖,侵袭,转移,划痕,周期和凋亡实验结果:相较于A2780细胞系,A2780 KI细胞系对顺钳的抵抗性增强A2780 KI 细胞系的生长速率较慢,但是1 U g/m L, 2 u g/m L和4 u g/m L的顺钳浓度干预 48h后,A2780和A2780 KI细胞系的抑制率分别为11. 23±1, 48, 26. 36±2. 76, 35. 53±2, 16 和 8. 73±0, 96, 20. 60±3. 4& 28. 84±2, 97, A2780 和 A2780 KI 细胞系的抑制率存在显著差异,具有统计学意义(P<0. 05)顺钳可以抑制 A2780和A2780 KI细胞系的迁移和侵袭能力(p<0. 05),且随着顺钳浓度的提 高,抑制作用越明显。
在0 U g/m L, 1 u g/m L, 2 u g/m L和4 P g/m L的顺钳浓度干预下,迁移实验中A2780和A2780 KI细胞系的小室细胞计数分别为225. 9±9, 061, 158. 9± 7. 187,95. 9± 13. 153, 72. 8±2. 936 和 257. 3±10. 275, 170. 5±7. 412, 139. 5±5. 720, 100. 3±10. 253o侵袭实验中A2780和A2780 KI细胞系的小室细胞计数分 别为 281. 5±9, 889, 68. 2±6, 653, 46. 2±5, 116, 41. 9±3, 695 和 351. 7±19. 202, 106. 4±5, 473, 80. 2±6, 426 和 53. 1±5, 840划痕实验中,在 0 P g/m L, 1 U g/m L, 2 u g/m L和4 u g/m L的顺钳浓度干预24h后,A2780细胞系的迁移率分 别为 A2780 KI 细胞系的 81. 40%, 87. 31%, 90. 73%和 78. 24%顺钳作用下,A2780 KI细胞系的迁移和侵袭能力都较A2780细胞系强,差异 有统计学意义(p<0. 05) o A2780和A2780 KI细胞系凋亡率分别为4. 15%, 7. 60%, 8. 48%, 13. 77%和 2. 60%, 3. 99%, 7. 22%, 10. 19%。
A2780 和 A2780 KI 细胞系 S 期比率分别为 16. 15±2. 1, 20. 28±1, 6, 25. 04±1, 2, 29. 7±3, 5 和13. 61±3, 5, 16. 64±6. 2, 19. 71±4. 1, 16. 69±2. 3A2780细胞系较A2780 KI细胞系凋亡率和S期比率显著增大,具有统计学意 义(p<0. 05)结论:在顺钳作用下,A2780 KI细胞系的增殖,迁移和侵袭能力 较A2780细胞系强,另一方面,A2780细胞系较A2780 KI细胞系易发生凋亡和S 期阻滞这也意味着LIPG/rs9958734突变型在顺钳压力下往往通过诱导S期阻 滞和凋亡。