脂肪酶的生物学改造摘要：脂肪酶作为重要的生物催化剂，由于其反应条件温和、绿色环保被广泛应用于能源、食品、生物医药等领域，但适用于大型工业生产的经济型脂肪酶仍然有限，如何改造、开发出更多适用于工业生产中的理想型脂肪酶成为近年来研究热点综述了脂肪酶结构、催化机理，以及近年来脂肪酶改造的相关技术以期给相关科研工作者的未来研究工作以启发关键字：油脂；脂肪酶；改造；生物技术The biological modification of lipases and its application in oil industry随着绿色工业概念的提出，以酶作为催化剂的生物催化以其底物的高度选择性、专一性以及产物环境友好型的特点，逐渐成为工业生产中被广泛应用的催化手段脂肪酶是工业生产中重要的酶制剂[1]，具有催化特异性高、反应条件温和、副产物少以及环境友好等特点，被广泛应用于工业生产中，但是脂肪酶制剂造价高、酶与底物难分离、多余游离脂肪酶难回收等问题制约了天然脂肪酶的工业应用近年来，大量研究致力于对脂肪酶进行改造，生物技术的飞速发展更为为改造出更多适用于工业生产的理想脂肪酶制剂提供了有利的技术支持本文将综述脂肪酶的结构、催化机理及利用生物学技术对其进行改造的研究现状，对比各种技术优缺点。
1 脂肪酶的概述1.1脂肪酶概述脂肪酶（Lipase， E.C. 3.1.1.3）又称酰基甘油水解酶，广泛来源于多种动植物及微生物[2]脂肪酶作为一种生物催化剂，能够催化水解、酯化、醇解等生化反应，例如脂肪酶在水相条件下主要参与羧酸甘油酯水解，进而生成甘油、甘油单酯、甘油二酯及脂肪酸等物质[3]脂肪酶水解底物具有多样性，除了常见的的甘油酯以外，很多不同分子质量的脂类例如部分聚合物等都可以作为其催化底物脂肪酶催化过程中，通常会产生多种催化底物，主要有以下两个原因：一是脂肪酶能够催化的生化反应种类很多，且都是可逆反应；二是在多数水解过程中，脂肪酶的水解活性很大程度上依赖于外界提供的反应界面的特点，出现界面激活效应，可能会出现反应不完全的情况[4]脂肪酶在催化反应中具位点选择性、立体选择性及化学选择性的特点，催化过程不需要辅因子，且具有高催化活性[5]1.2脂肪酶结构1990年，Brad等解析了米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor miehei lipase，RML）的晶体结构[6]，随后Winkler等解析了人源胰脂肪酶（Pancreatic human lipase，PHL）[7]的晶体结构，到目前为止，已经有数百种脂肪酶的结构被解析出来。
研究表明，脂肪酶结合不同底物，或者所处溶剂环境不同，都可能曾现出不同的构象状态分析脂肪酶的序列结构发现，来源于不同物种的脂肪酶基因序列相差很大，其一级结构相差甚远，氨基酸组成的相似度很低，所以其同源性相对较低，而且不同脂肪酶的蛋白分子大小也相差甚远，从16.25 kDa（Rhizomucor oryzaede 的脂肪酶）[8]到116.6 kDa（人体的激素敏感脂肪酶）[9]，尽管如此，不同来源的脂肪酶在其二级和三级结构上相对保守，都具有相似的α/β水解酶折叠结构，其活性中心是一个保守的催化三联体结构（由丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸组成）[10]1.3 脂肪酶的催化机理脂肪酶的催化过程主要分为四个阶段，如图一所示：（1）脂肪酶与底物结合：当疏水性底物进入反应体系时，脂肪酶催化活性中心上方的由α螺旋组成的盖子结构发生构象变化，打开并暴露其催化反应的活性位点，底物进入活性中心，与脂肪酶结合2）形成四面体的中间复合物：底物进入催化中心后，脂肪酶活性中心上的丝氨酸被活化，其羟基氧原子对底物酯键上的羰基进行亲核攻击，羰基双键断裂，四种不同原子与该羰基碳原子键合，四面体中间复合物形成3）形成酰基-酶中间复合体：四面体中间复合物形成后，发生扭转，催化活性中心的组氨酸残基上的质子（在形成四面体复合物的工程中从活性中心的丝氨酸中获得）传递给底物酯键上的羟基，底物酯键随之断裂，生成的醇羟基部分脱离酶与底物形成的中间复合体，而底物的羰基与活性中心的丝氨酸结合，形成了新的酯键，至此脂肪酶与底物形成了一种酰基-酶共价中间复合体形式。
4）脱酰基：活性中心的组氨酸失去质子以后，迅速从极性的底物分子水或醇中获取质子，底物分子水和醇被活化，攻击活性中心酰基化的丝氨酸上的碳原子，丝氨酸与底物酯键的酯键断裂，底物释放其羧基部分的产物（水解释放酸，醇解释放酯），同时脂肪酶完成了去酰基化过程[2]图一 脂肪酶催化机理[2]Fig1. The catalytic machanism of lipase2 脂肪酶的生物学改造近年来，以酶为基础的生物催化作为一种环境友好型、催化特异性强的新型催化方式，其相对于传统的化学催化，显示出越来越明显的优势但是由于酶催化的底物分子专一性强，使用范围被限制，提高了工业应用的成本另一方面，由于酶的反应条件温和，其适用的催化范围受到各种反应条件的限制，如PH、温度、溶剂等所以，如何在保持生物催化优势的基础上，改善酶应用于工业生产的劣势，成为近年来的研究热点作为油脂改造中应用最广泛的生物催化剂，脂肪酶通过催化酸解、酯化、醇解、转酯化、氨解、水解[11]等过程实现油脂改性目前为止，国内外学者对多种来源于不同种属的脂肪酶进行改造及纯化，并应用于油脂工业进行商业化生产伴随着生物学领域的飞速发展，生物学技术日趋成为改造酶催化性能的常用手段[12]， 生物信息学、计算机模拟、序列分析、基因突变与合成以及蛋白质工程等相关技术被广泛应用到酶改造中，发展出了定向进化、理性设计、从头设计技术，以及蛋白质表面修饰及固定化技术，这些技术不断完善，并相互融合，使酶改造进入了主动时代，对脂肪酶催化特性的改造更具有针对性[13]。
2.1定向进化定向进化以蛋白质自然进化为基础，在体外的实验环境中来模拟生物体自然进化的实验手段，定向进化通过随机突变氨基酸，构建突变重组文库，再进行定向筛选，以得到预期的目的蛋白这种非理性的蛋白筛选及进化方法，在不了解酶蛋白的结构及催化机制的条件下，也可以有目的的获得具有特定催化性能的突变体酶蛋白，在改造酶催化性能的过程中被广泛应用[14]在定向进化中，构建突变重组文库的手段主要包括易错PCR[15-17]、DNA 改组[18]、寡聚核苷酸重组（Assembly of designed oligonucleotides，ADO）[19]等，高通量筛选技术主要有流式细胞仪和微孔板筛选技术例如黄瑛等利用该技术对来源于短小芽孢杆菌的脂肪酶基因BpL进行定向进化，获得了BpL1-7和BpL2-1369两种突变菌株，其脂肪酶催化活力较野生型分别提高了2倍和6倍[20]苏宏飞等[21]利用DNA改组技术对脂肪酶Lip98进行定向改造，获得两个突变体F92A和I199F，其热稳定性与野生型相比分别提高了1.5和3.5倍定向进化方法高度依赖于完善的突变重组文库以及高效的高通量的定向筛选方法[22]，存在着无效突变多，筛选困难，工作量大等问题。
2.2 理性设计酶的理性设计是根据脂肪酶的已知结构信息以及催化机理，进一步对脂肪酶的结构与功能之间的关系进行分析，找出影响酶的稳定性、催化活性、折叠方式等的主要位点，然后对其进行针对性的修饰或替换，以改变脂肪酶的相应性状[13, 23]理性设计实施基础的前提是脂肪酶三维结构的解析及其催化机理明确， 随着X射线晶体学、核磁共振（NMR）、以及电子显微镜（EM）三大结构生物学手段日益成熟，使越来越多的蛋白质结构得到解析，蛋白质数据库（PDB）日益完善[24]传统的理性设计方法主要基于实验以及序列分析，近年来，计算机辅助设计被广泛应用于脂肪酶的理性设计中，成为主要的研究方向基于蛋白质的结构信息，利用计算机算法对酶与配体的结合自由能，溶剂选择性等方面进行理性设计，通过序列比对分析氨基酸序列的保守性，利用同源建模方法对为未知蛋白进行模型构建，得到蛋白结构的理论模型[25]同时根据蛋白质与配体之间的柔性对接以及刚性对接，发展出分子对接的计算分析方法，分析蛋白质与配体的结合自由能变化，以评价蛋白质的配体选择性通过分子动力学模拟对蛋白质与配体结合体进行分析和预测，分析环境体系等因素对其结构及相互作用的影响，得到新型酶蛋白的相关催化活性、稳定性以及底物选择性等理论数据，从而选择最合适的突变体并指导实验，得到目标酶蛋白[26]。
2.3 半理性设计由于随机突变的定向进化技术构建出的突变体文库数量巨大，筛选困难，而理性设计需要对脂肪酶结构、催化机理以及功能有深入的了解，限制了脂肪酶的改造基于这两种改造方法建立的半理性设计改造思路取长补短，先用理性设计的思路，利用生物信息学手段对目标脂肪酶已有信息进行分析，将定向进化的突变位点锁定在有限几个氨基酸上，大大缩小了突变体文库的数量，且有效突变率大大增高[27]例如，Reetz课题组基于脂肪酶有义突变主要集中在催化活性位点附近这一机理，提出了迭代饱和突变法（Iterative saturation mutagenesis，ISM）[28]，先分析酶的结构、序列信息，选取活性中心关键位点，分别对这些位点进行饱和突变，从中筛选有义突变，对这些突变体再进行饱和突变，通过这样的多轮迭代饱和突变，找到最适突变体随着计算机运行能力不断加强，算法不断发展完善，越来越多的计算软件用于半理性设计中，成为未来半理性设计的重要研究方向[29]2.4蛋白修饰为了弥补氨基酸定点突变只能选择19种氨基酸对其进行替换的不足，蛋白质修饰方法被应用于酶蛋白改造中，使酶蛋白在目标位点上的改造更多样脂肪酶蛋白的表面修饰主要通过对主链的剪切、连接以及对侧链氨基酸残基或者某个官能团进行化学修饰来实现。
通过对酶蛋白进行表面修饰，可以增强其在不利催化环境中的稳定性及催化活力如Abuchowski等的研究表明，聚乙二醇（PEG）可以通过改变脂肪酸的主链结构或侧链基团对其修饰，使脂肪酶在有机溶剂中更稳定，溶解性更强[30]2.5固定化在自然条件下，游离酶极易失活且回收困难，所以脂肪酶通常需要进行固定化操作才能应用于工业生产中研究发现，通过对脂肪酶进行固定化，可以使酶具有更高的环境耐受性以及稳定性[26]，利于回收再利用，为后续的连续化工业生产提供便利目前工业生产上广泛应用的脂肪酶固定方法主要有四种：交联法、包埋法、吸附法以及共价法[26-27]近年来，由生物技术结合纳米技术的生物纳米技术作为一种前沿的生物技术，也被开发应用于脂肪酶的固定化研究中，利用纳米载体，包括纳米片、纳米纤维、纳米管等作为载体，对脂肪酶进行固定化由于纳米载体有较大的比表面积，提高了载酶量，且抗拉强度高，可重复利用，不易被破环[28]另一种新型的固定化方法：定向固定方法也被应用于脂肪酶固定中，由于酶在固定化载体上的排列方式是无序的，造成酶的催化活性中心接触到底物的概率变低，这种定向固定化技术通过使酶蛋白活性位点远离固定化载体，使底物更容易于脂肪酶结合，提高了催化效率[16]。
3 几种改造技术比较：通过对目前脂肪酶主要改造策略进行分析，总结了几种策略的主要技术特点，如表1所示，每种技术都有自己一定的局限性，而多种技术相结合对脂肪酶进行改造，对脂肪酶结构和催化机理更了解的同时开发更多适用于工业的新型脂肪酶成为未来研究的重要方向表1.几种重要脂肪酶改造技术的比较改造技术主要技术手段特点总结参考文献定向进化易错PCR具有一定的碱基偏好性、突变效率低、需要多轮突变[31]DNA 改组突变效率高、能组合多个优化的参数，但基因序列的一致性要达到70%以上[21]寡聚核苷酸重组对同源性要求较低[32]理性设计引入二硫键提高脂肪酶热稳定性，但容易引起错误折叠[33]计算机模拟辅助理性设计分析分子和原。