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1、PCR室室内质控标准操作程序1.目的 控制实验的重复性、精密度，并检测其准确度的改变，提高本室常规工作中的批间、批内标本检测的一致性。2. 适用范围 本程序适用临床基因扩增检验质量负责人和检验人员对DNA和RNA分析的室内质量控制。 3制定依据 临床基因扩增检验技术申子瑜李金明主编人民卫生出版社2002年第一版 4. 职责 实验室质量负责人和检验人员负责本规程的执行。评估检测结果正确与否，判定当日结果是否可以被采用。5、操作步骤5.1血清质量控制品a)质控品的来源：卫生部临检中心或试剂盒内质控品。b)质控品与样本同时处理，排列顺序为：标准品或校准品，阴性质控品，阳性质控品，临床样本。c)质控品
2、的处理及分析判断。d)实验结果的判断：实验结果合格，即发报告；实验结果不合格，报告室主任，会同有关人员，查找原因，妥善解决。e) 记录每次检测质控结果。f) 记录失控原因及纠正措施。5.2室内质控图的使用方法：描点：a）图中X线为靶线，X2s为警告线，X3s为失控线。对于同一批号的质控血清不论使用几个月，其空图均不变化。只要将图纸上方“起止日期”项填入每个月的实际起止日期即可。b）每天将该批号质控血清按有关规定程序复融随同病人的标本同时检测。将日期、检测结果和操作者如实记录在图下方的相应位置，并按前面的方法画出图上的对应点，用直线将该点与前一天的点连接。c）月底计算当月全部质控血清检测结果的X
3、、s和CV，并进行图形分析和小结，将质量控制图存入质控资料档案。图形分析a）如果在X3s线以外，则为失控，应立即报告有关负责人，迅速查找原因。必要时复测标本，然后方可发出报告，并将失控情况、查找过程及处理结果等详细记录。b）如果在X2s线以外，或出现连续6点以上在一侧等规律变化，均应立即向有关负责人反映，并积极查找原因。但当天的检验结果一般可以发出。通过观察图形的规律性变化进行误差分析，消除误差来源a）曲线漂移：提示有系统误差，准确度发生了一次性的向上或向下改变。这种变化往往是由于一个新的情况引起的。如更换不同批号试剂，启用新批号的质控血清、操作人员的变换等。在找原因时，应重点注意“漂移”前后
4、发生了那些变动的因素。b）趋势性变化：向下或向上的趋势性变化表明检测的准确度发生了渐渐地变化。这种变化往往是由于一个逐渐改变的因素造成的。如质控血清的降解，试剂效价的降低等。c)连续多点分布在靶值一侧：目前，一般认为质控血清的检测结果连续6天以上出现在靶值同一侧，则应迅速查找原因，争取尽快使之回复围绕在靶值随机分布的状态。因为按照统计学原理，由纯随机误差造成的这种情况的可能性很小。连续6天以上出现在靶值同一侧可能性小于1.5。因此凡出现连续6天以上出现在靶值同一侧者均有可能存在非随机误差因素。如结果与靶值偏离并不太大，不会给临床使用带来太大影响时，一般化验报告可以照常填发。d)其他规律变化：（
5、周期性等）5.3通过图形的资料对比进行误差分析，消除误差来源a)每个月的月底将该月的全部质控血清检测结果的X和s与该批测定的X和s 进行比较。如果X发生了变化，说明准确度发生了变化提示有非随机误差存在。如果当月s不同侧表明检测的精密度发生了变化。b)将使用同一批号质控血清的CT值的X和s按月份列出。如果X逐在月上升，应考虑保存不当造成的试剂效价降低或质控血清本身出现降解。如果各月份X基本一致而s逐月加大，则主要提示常规工作的精密度下降，应重点从操作、管理上找原因。5.4失控限的判定：当阳性对照呈假阴性或阴性质控呈假阳性时为失控；当阳性标本呈假阴性或阴性标本呈假阳性时为失控。此次实验结果不合格，
6、报告室主任，会同有关人员，查找原因，妥善解决，并将失控情况、查找过程及处理结果等详细记录。5.5阴性对照品失控的处理程序：5.5.1阴性对照A、B为假阳性时，则应考虑为：a.试剂污染；b. 扩增产物的“污染”。可作以下实验鉴定：取4个空管打开静置于标本制备区60分钟，然后加入扩增反应混合液同时以水替代核酸样本进行扩增，如为阳性，而上述仅含扩增反应混合物的管为阴性，即可排除试剂污染的可能，表示实验室有扩增产物“污染”。此时，应立即报告实验室负责人，然后先暂时停止PCR实验，采取各种有效的消毒清洁工作直至产物污染彻底消失后才可进行PCR实验。如果有试剂污染时，应更换另一批号的试剂进行重复实验，待重
7、复实验阴性质控品无失控后，方可报告结果。5.5.2如果以上实验鉴定没有实验室的产物污染时，则应判断为实验操作过程中所致的标本间的交叉“污染”，出现这种情况很大程度上属于偶然误差，具体地说，如强阳性的标本气溶胶经加样器所致的污染，强阳性标本经操作者的手所致的污染、使用的离心管核酸提取时在较高温度温育时盖子崩开。因此在PCR实验前离心管、滤心吸头的质检以及在实验中一发现手套可能有污染就立即更换手套显得尤为重要，并且PCR实验人员的严格按照操作程序进行实验的工作态度是实验成败的关键。5.6阳性对照品失控的处理程序：5.6.1临界阳性对照品失控的原因有：a.临界对照品是否还好：可更换新的临界对照品，进
8、行重复实验，如果对照品无失控则表示上次实验的临界对照品已失效，不能再用于实验。如果还有失控现象，则应考虑：b. 核酸提取过程中的随机误差：如核酸性对照失控。如核酸提取中的丢失、裂解温度不够、裂解不充分、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留等。应重新严格核查该过程中的各步骤是否出错，然后重新操作一遍，临界对照品无失控现象后才报告结果。如果仍失控，则考虑：仪器问题b.仪器问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。此时应请厂家及时校正仪器。仪器校正好之后再重复操作如无失控则可报告结果。如果仍有失控现象则应考虑：试剂问题c.试剂的问题：如Taq酶的失活、探针的纯度及标记
9、效率和核酸提取试剂的效率、试剂的灵敏度等。可更换另一批号的试剂重复实验，无失控结果后才可发出报告。5.6.2强阳性对照品失控的原因和临界阳性对照品失控的原因基本相同，但最首要的原因应考虑试剂的问题。由此可见，在PCR实验前对试剂的质检是必不可少的环节之一。5.7阳性标本失控的处理程序：5.7.1失控的主要原因有：a.标本的收集是否符合要求（包括标本采集的时间是否合适、标本采集部位的准备工作是否适度、标本的类型和采集量是否合适、采集的标本所含的细胞数量和核酸总量是否足够、采样容器是否合格。）；b.标本保存是否正确；c.标本的运送是否延误；d.标本在核酸制备、扩增检测中所存在的随机误差（与上述阳性
10、质控品的失控原因相同）。5.7.2处理程序：a.如果是标本收集、标本保存、标本运送等环节所导致阳性标本失控，则应严格按要求重取标本后复查才可报告结果。另外还应对临床标本采集人员、标本运送相关人员进行必要的培训。b.如果是标本的核酸制备、扩增检测中所存在的随机误差问题，则可参照以上所述阳性质控品失控的处理方法，另外对PCR实验人员的培训非常重要。5.8阴性标本失控的处理程序：5.8.1主要原因有：a.标本采集容器是否合格（是否使用一次性采样材料、使用的玻璃器皿是否经过高压灭菌）；b.标本运送过程是否存在污染因素（如没有密闭、管漏等）；c.标本在核酸制备、扩增检测中所存在的随机误（与上述阴性质控品的失控原因相同）5.8.2处理程序：a.如果是标本采集容器、标本运送等环节所导致阴性标本失控，则应严格按要求重取标本后复查才可报告结果。另外应加强对临床标本采集人员、标本运送相关人员的防污染意识。b.如果是标本的核酸制备、扩增检测中所存在的随机误差问题，则可参照以上所述阴性质控品失控的处理方法。本文涉及以下图表，见SOP文件末的附图表：室内质控记录图-附图03
