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1、目录常用分子生物学技术的原理及应用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology第21章目录第一节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique目录n核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)
2、。一、分子杂交与印迹技术的原理目录目录（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。 目录用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 （二）探针技术目录二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹 (Southern Blotting)（二）RNA印迹 (Northern Blotting)（三）蛋白质的印迹 (Western Blotting)用于基因组
3、DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 用于RNA的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。目录n其他：斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization)DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip)三种印迹技术的比较分子杂交实验目录放射自显影照片目录DNA点阵目录第二节聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction目录5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA一、PCR技术的工作原理55 555 5 55目录Cycle 355 555 5
4、555 5 55 555 52530 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+n PCR体系基本组成成分目录n PCR的基本反应步骤变性95C延伸72C退火Tm-5C目录利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。 二、PCR技术的主要用途（一）目的基因的克隆目录利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进
5、行嵌和、缺失、点突变等改造。 PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。 （三）DNA和RNA的微量分析（二）基因突变目录将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性 。（四）DNA序列测定（五）基因突变分析目录 逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RN
6、A进行定性及半定量分析的最有效方法。 （一）逆转录PCR技术三、几种重要的PCR衍生技术目录 原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。 原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。（二）原位PCR技术目录（三）实时PCR技术实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。 目录n实时PCR技术原理QR3355上游引物下游引物荧光标记
7、引物RQ 3355目录第三节核酸序列分析Nucleic Acid Sequence Analysis目录n核酸序列分析的基本原理： 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (Sanger法)目录一、DNA链末端合成终止法目录GATC 测序反应 电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5 3 正极负极ddGddAddTddCn链末端合成终止法测定DNA序列的原理目录二、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sa
8、nger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 目录ddGddAddTddC红色荧光绿色荧光黄色荧光蓝色荧光电泳DNA序列自动分析原理及结果图目录第四节基因文库Gene Library目录 基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) n基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。目录一、基因组DNA文库基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括
9、所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。 用于构建基因组文库的载体有噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。目录n基因组文库和cDNA文库的构建和筛选目录第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选n基因组文库筛选结果举例目录cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。 二、cDNA文库目录第五节生物芯片技术Biological Chip Technique目录是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片
10、进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。 一、基因芯片n基因芯片(gene chip)目录n基因芯片工作流程示意图目录是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应n蛋白质芯片(protein chip)n蛋白质芯片作用原理目录第六节生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Prote
11、in-DNA Interaction Study目录一、蛋白质相互作用研究技术 酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术目录标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。 目录标签融合蛋白沉淀实验流程示意图目录（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途目录n酵母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信
12、息学推测。 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。目录电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技
13、术（一）电泳迁移率变动测定目录放射自显影未结合探针结合有蛋白的探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物1X10X10X未标记探针10Xn凝胶迁移实验结果示意图目录染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。（二）染色质免疫沉淀法目录n染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图目录遗传修饰动物模型的建立及应用The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 第七节目录n转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合
14、入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。 转基因被导入的目的基因转基因动物(transgenic animal)目的基因的受体动物一、转基因技术目录n核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物的一个体细胞核全部导入另一个体的去胞核的的激活的卵细胞内，使之发育成个体，即克隆(clone)。二、核转移技术目录n基因剔除技术(gene knock out) 也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。三、基因剔除技术目录将灭活的基因放入胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)中，使这一灭活基因通过同源重组取代原有的目的基
15、因，筛选到基因已定点灭活的细胞后，通过显微注射将细胞注入小鼠囊胚中。细胞在小鼠囊胚中参与胚胎的发育，最终形成嵌合体小鼠。 n操作方式目录n建立动物模型 单基因决定疾病模型 基因剔除获得性突变(gain-of-function mutation) 多基因决定疾病模型四、基因转移和基因剔除在医学发展中的作用目录第八节疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes目录 功能克隆(functional cloning) 定位克隆(positional cloning)n克隆疾病相关基因的策略目录n定义 从对一种致病基因的
16、功能的了解出发来克隆该致病基因。（一）功能克隆n应用 生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。目录利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。用不同人的DNA片段转化与人类遗传疾病具有类似表型的突变酵母，可以恢复(rescue)正常表型的片段中所含有的基因即可能为致病基因。这种实验称为功能互补试验 (functional complementation assay)。目录（二）定位克隆n定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。n系统的定位克隆工作 遗传学分析(确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析 分子生物学分析染色体异常(缺失、易位等)分析、基因文库的筛选与基因克隆目录基因诊断和基因治疗第九节Gene Diagnosis and Gene Therapy目录n定义直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。一、基因诊断(Gene Diagnosis)n特点以基因作为检查材料和探察目标，属于“病因诊断”。针对特定基因，特异性强。所用技术具有放大效应，故诊断灵敏度高。适用性强，诊断范围广。目录1. DNA序列分析用于基因突
