电泳技术 n带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis，EP)利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术n1937年瑞典科学家Tiselius建立了“移界电泳法(moving boundary EP)”，成功地将血清蛋白质分成清蛋白、1-、2-、-和-球蛋白5个主要成分他于1948年荣获诺贝尔奖蛋白质分子在不同pH下的解离状态 NH3+ NH3+ NH2P P P COOH COO- COO- pHpI pHpI pH pI pHpI 分子带负电荷，在电场中向正极移动;pHpI分子带正电荷，在电场中向负极移动;电泳的分类 按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、平板电泳； 按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳； 按电泳的原理分类： 不同型号的毛细管电泳仪及其工作原理 毛细管电泳1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术高效毛细管电泳电泳仪DYY-11DYY-12C电泳槽迷你双垂直电泳槽水平电泳槽等电聚焦多用电泳槽卧式电泳槽紫外透射仪手提式暗箱式第一节 电泳的基本原理n 一、泳动度n带电颗粒在单位电场中泳动的速度称迁移率或泳动度(mobility)，可用下式表示： d/t dl U = = = E V/l vtn式中U(也可以用m表示)：泳动度cm2(Vs)；：颗粒泳动速度(cms)；E：电场强度(Vcm)；l：支持物的有效长度(cm)；V：实际电压(V)；d：颗粒泳动的距离；t：通电时间(s或min)。
电泳后通过测量v、t、d、l，即可计算出被分离物质的泳动度泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量、颗粒大小 和形状有关被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为： F = E Qn式中 E：电场强度，即每厘米支持物的电位降；Q为被分离物所带净电荷一、泳动度二、影响泳动度的因素 n1电场强度 是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度)电场强度越高，则带电颗粒泳动越快根据电场强度的不同，电泳可分为两种n(1)常压(100500 V)电泳 其电场强度为210 Vcm分离时间较长，从数小时到数十小时，适合于分离蛋白质等大分子物质n(2)高压(200010000 V)电泳 其电场强度为50200Vcm，电泳时间很短，有时只需几分钟多用于分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质 二、影响泳动度的因素n2溶液pH n溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的多少n对蛋白质而言，溶液pH值离等电点(pI)越远，则颗粒所带的净电荷越多，泳动速度也越快；反之，则越慢二、影响泳动度的因素n3溶液的离子强度 缓冲液离子强度越高，则颗粒的电动电势越小，泳动度也越小一般最适合的离子强度在O.02O.2之间。
二、影响泳动度的因素n4电渗 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗n如纸电泳时，滤纸吸附OH-带负电荷，与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动二、影响泳动度的因素n5温度 电泳时会产生焦耳热，使介质黏度下降，分子运动加快，迁移率增加，同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活n因此电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置n6支持物 要求是均匀，吸附力和电渗小，机械性能好，便于染色或紫外光下检测，故最好透明，无紫外吸收n常用的支持物?第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 n聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法一、聚丙烯酰胺凝胶的特点n聚丙烯酰胺凝胶是由 单体丙烯酰胺(Acr)和 交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)n在加速剂和催化剂的作用下聚合，并联结成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N, N-甲叉双丙烯酰胺CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH( )n( )n( )m( )m聚丙烯酰胺凝胶的优点n在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。
n化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应n对pH和温度变化较稳定n几乎无电渗作用n样品不易扩散，其灵敏度可达10-6gn凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节n分辨率高nPAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定相对分子质量、等电点等 二、凝胶聚合的原理及有关特性 n 1聚合反应 n凝胶的聚合常用过硫酸铵(AP)为催化剂，四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂n碱性条件下凝胶易聚合，室温下7.5的凝胶在pH8.8时30 min聚合，在pH4.3时约需90 min2. 凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系 凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比凝胶总浓度（T）和交联度（C）的计算公式分别为：Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%C =Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%T =凝胶越浓，凝胶孔径，所受阻力，机械强度在浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果因此，把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。
3.凝胶浓度与被分离物相对分子质量的关系三、PAGE凝胶电泳操作n1、配制缓冲液；n2、配制凝胶n3、加样n4、安装装置n5、电泳：电场强度为1025V/cm, 0.52h.n6、显色:染色、漂洗、检测PAGE电泳操作 nPAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类：n连续电泳体系只有一层凝胶，缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；n不连续电泳体系采用二层或三层性质不同的凝胶，由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好n不连续体系由电极缓冲液、样品胶、浓缩胶及分离胶组成，两层玻璃板中排列顺序依次为上层样品胶、中间浓缩胶、下层分离胶聚丙烯酰胺凝胶垂直管型盘状电泳夹心垂直电泳示意图凝胶膜示意图聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳四、不连续凝胶电泳的特点n在不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高 1样品浓缩效应n(1)凝胶孔径的不连续性 样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。
n在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢n因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带 2分子筛效应 n大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应n蛋自质进入pH8.9的同一孔径的分离胶后，分子小且为球状的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带n这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出n图中圆球分别代表大、中、小3种不同分子量的蛋白质大、中、小分子分别滞留在与分子大小相当的凝胶孔径中，不再前进，因而分离成3个区带 3电荷效应 n在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率净电荷多，则迁移快；反之，则慢n因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带，因而称为区带电泳A. 样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：n缓冲液成分及pH的不连续性n电位梯度的不连续性 缓冲液浓缩胶样品分离胶A. 样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：n凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH6.8) 蛋白质从“”极向“”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。
缓冲液样品浓缩胶分离胶A. 样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：n凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“”极向“”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩 缓冲液样品浓缩胶分离胶A. 样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：n凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“”极向“”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩 缓冲液浓缩胶分离胶A. 样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：n凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“”极向“”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩 缓冲液浓缩胶分离胶B.电荷效应n蛋白质样品进入分离胶后 pH增大(pH 8.9)，Gly解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动n由于各种蛋白质pI不同，所载有效电荷不同，因此质点的 有效迁移率不同，形成不同区带 缓冲液浓缩胶分离胶C.分子筛效应n分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的 泳动速度，即分子筛作用。
分子量小，形状为球形的泳动速度最快 缓冲液浓缩胶分离胶n定义： 四、SDS-PAGE电泳nSDS即十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS)是阴离子表面活性剂，它能以一定的比例和蛋白质结合，形成一种SDS一蛋白质复合物n此复合物可用具有SDS的聚丙烯酰胺凝胶(包括连续的和不连续的系统)电泳进行分离，通常把这种电泳称为SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS-PAGE)它的主要用途是分离蛋白质和测定其分子量1.SDS-PAGE原理 n聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效地把不同类型的蛋白质分开的主要依据，是样品中各种物质的电荷和分子量的差异性n而SDSPAGE的主要依据，则是各种物质分子量的差异性n因为当SDS与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子问的电荷差别就降低乃至消除了n与此同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS一蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异 n当蛋白质的分子量在17,000165,000之间时，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系一般用下式表示： lgMr=lgK-bm=K1-bm n式中，Mr代表蛋白质分子量，K、K1代表常数，b代表斜率，m代表迁移率。
将已知分子量的标准蛋白质在SDS -聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量五、等电聚焦电泳n利用pI不同，以PAGE为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体，在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成pH梯度.n蛋白质在凝胶中迁移至其pI的pH处，即不再泳动而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(isoelectric focusing-PAGE，IEF-PAGE) 1两性电解质载体 n两性电解质载体是用多烯多胺和不饱和酸合成的脂肪族多氨基多羧基化合物的混合物，其中不同的分子因氨基和羧基比例不同而具有不同的pIn目前，两性电解质载体由于生产厂家不同，合成方式各异而有不同的商品名称，如。