血红蛋白的提取和分一轮复习

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1、生物技术在其他方面的应用考纲要求定位解读1.菊花的组织培养 1.说说明植物组织组织 培养的基本原理，学习习植物组织组织 培养的基本技术术2.果胶酶在果汁生产中的应用 2.简简述果胶酶的作用3.检测果胶酶的活性4.探究温度和pH对果胶酶活性的影响及果胶酶的最适用量3.血红蛋白的提取和分离 5.了解血红蛋白的提取和分离的基本过程和方法4.胡萝卜素的提取 6.了解有关胡萝卜素的基本知识和提取胡萝卜素的基本原理血红蛋白的提取和分离考点三 一、一、实验实验实验实验 原理原理分离生物大分子的基本思路分离生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。依据什么来分离和提

2、取蛋白质？ 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。血血红红蛋蛋白白的的提提取取和和分分离离蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理凝凝胶胶色色谱谱法法概念概念根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。蛋白质分离方法蛋白质分离方法原理原理 当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分

3、子因此得以分离。依据的特性是：依据的特性是：蛋白质分子量的大小蛋白质分子量的大小。电泳电泳概念概念原理原理阅读阅读 第65页页的相关内容，回答以下问题问题 ： 1、电电泳的概念； 2、电电泳的原理； 3、电电泳的种类类； 4、SDS的作用。基础知识电泳1、概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2、原理 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。基础知识 电泳 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品

4、中各种分子的分离。3、电泳的类型琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。测定蛋白质分子量。应应应应用用聚丙聚丙烯烯酰酰酰酰胺凝胺凝胶胶蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。原理基础知识（三）电泳4、实例 SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电

5、荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 SDS作用机理 SDS SDS作用作用为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS。基础知识（三）电泳1、凝胶色谱法的别名：分配色谱法 是根据相对分予质量的大小分离蛋白质的有效方法。 4、凝胶 性质：一些微小的多孔球体，球内含许多贯穿的通道；化学本质：多糖类化合物： 实例：葡聚糖、琼脂糖：2、凝胶色谱法的概念： 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。基础知识（一） 凝胶色谱法3、依据的特性蛋白质分子量的大小。5 5、具体过程、具体过程基础知识（一） 凝胶色谱法5

6、 5、具体过程、具体过程1、我们们在什么地方遇到过缓过缓 冲物质质的？2、缓缓冲物质质有哪些？3、缓缓冲溶液的作用是什么？4、怎样样配制缓缓冲溶液？基础知识（二）缓冲溶液1、缓冲溶液概念 在一定的范围围内，能对对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释释不引起溶液PH发发生明显变显变 化的作用叫做缓缓冲作用，具有缓缓冲作用的溶液叫做缓缓冲溶液。能够够抵制外界的酸或碱的对对溶液的PH值值的影响，维维持PH基本不变变。2 2、缓冲溶液作用作用3、缓冲溶液配制 通常由12种缓缓冲剂剂溶解于水中配制而成。调节缓调节缓 冲剂剂的使用比例就可以制得在不同PH范围围内使用的缓缓冲液。基础知识（二）缓冲溶液弱酸和弱酸盐

7、组合H H2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3 CHCH3 3COOH/CHCOOH/CH3 3COONaCOONa4、缓冲溶液的组分分类弱碱和弱碱盐多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐NHNH4 4OH /NHOH /NH4 4CICINaHNaH2 2POPO4 4 /Na/Na2 2HPOHPO4 4KHKH2 2POPO4 4 /K /K2 2HPOHPO4 4基础知识（二）缓冲溶液思考： 你认为认为 在血红红蛋白整个实验实验 中用的缓缓冲液是什么？ 它的目的是什么？ 使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)

8、和科学研究(活性)。 生物体内进进行的各种生物化学反应应都是在一定的pH下进进行的，为为了能够够在实验实验 室条件下准确模拟拟生物体内的过过程，就必须须保持体外的pH与体内的基本一致。因此，缓缓冲溶液的正确配制和pH的准确测测定，在生物化学的研究工作中有着极其重要的意义义。问：在生物化学的研究工作，为为什么要正确配制缓缓冲溶液和准确测测定缓缓冲溶液的pH？基础知识（二）缓冲溶液 二、二、实验实验实验实验 操作操作样品处理粗分离纯化纯度鉴定1.1.样品处理：样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。(1)(1)红细胞的洗涤红细

9、胞的洗涤: :洗涤目的洗涤目的: : 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。洗涤操作：洗涤操作： 1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2 min红细胞血 浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤涤3次，直至上清液没有黄色思考：1、洗涤涤的目的？ 2、怎样样洗涤涤？ 3、洗涤涤干净

10、净的标标志是什么？1 除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。 2 采样分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次3 直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。(2)(2)血红蛋白的释放：血红蛋白的释放： 加蒸馏水到原血液体积，再加40体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。(3)(3)分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液： 过程：过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。试管中溶液层次：试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红

11、蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。分离：分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。甲苯层甲苯层（无色透明无色透明）白色薄层固体白色薄层固体红色透明液体红色透明液体杂质沉淀层杂质沉淀层（暗红色暗红色）试管中溶液层次试管中溶液层次(4)(4)透透 析：析： 过程：过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。 透析目的：透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。透析过程动画演示透析过程动画演示（3 3）样品加入与洗脱）样品加

12、入与洗脱 调节缓冲液面：调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 滴加透析样品：滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 洗脱：洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 收集：收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明

13、色谱柱制作成功） 注意：注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。纯化（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱注意：注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。思考下面的问题：思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。 1 1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？目的是什么？ 2 2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的

14、分离有什么启示？你进行血红蛋白的分离有什么启示？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。3 3、你能描述血红蛋白分离的完整

15、过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？（三）（三）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）2. 2.试剂的配制：试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。1. 1.目的：目的：3.方法步骤骤：（略） 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价三、实验结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你

16、的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 3 3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？果？教学反馈 1凝胶色谱谱法是根据（ ）分离蛋白质质的有效方法。 A分子的大小 B相对对分子质质量的大小 C带电带电 荷的多少 D溶解度2缓缓冲液的作用是：在一定范围围内，抵制外界的影响来维维持（ ）基本不变变。 A温度 B pH C渗透压压 D氧气浓浓度3电