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1、血友病的发病机制及检测治疗血友病最早在欧洲王室内发现，曾被称作贵族病。现如今我国的发病人数约810万。这种病的发病机理到底是什么，以及我们应该如何治疗呢？血友病是由于遗传性凝血因子VIII（FVIII）和IX（FIX）基因缺陷，造成血浆FVIII和FIX含量不足或功能缺陷，引起的一组终生出血的凝血障碍性疾病，包括血友病A（FVIII缺乏）和血友病B（FIX缺乏），属X性联隐性遗传性疾病。FVIII基因定位于Xq28，全长186kb，由26个外显子和25个内含子组成。已发现约300多种基因突变，基因型与表型密切相关。点突变，小的基因缺失引起轻度FVIII缺乏。终止密码子，大的基因缺失，插入，移位
2、，无义突变往往引起严重的FVIII缺乏和临床表型。已证实FVIII 22内含子倒位突变引起FVIII严重缺乏是45%的重型血友病A的分子发病机制。最近在1%的重型血友病A中还发现FVIII内含子1倒位突变。控制因子凝血成分合成的基因位于X染色体。属于伴X染色体隐性遗传病。即，如患病男性(基因型：XbY)与正常女性(基因型：XBXB)婚配，子女中男性(基因型：XBY)均正常，女性(基因型：XBXb)为携带者；正常男性(基因型：XBY)与携带者女性(基因型；XBXb)婚配，子女中男性（基因型：XBY或XbY，其中XbY型为患者）半数为患者，女性（基因型：XBXB或XBXb，其中XBXb型为携带者）
3、半数为携带者；患者男性（基因型：XbY）与携带者女性（基因型：XBXb）婚配，所生男孩（基因型：XBY或XbY，其中XbY型为血友病）半数有血友病，所生女孩（基因型：XBXb或XbXb，其中XbXb型为血友病,XBXb型为携带者）半数为血友病，半数为携带者。约30无家族史，其发病可能因基因突变所致。血友病症状在我国，血友病的社会人群发病率为510/10万，婴儿发生率约1/5000。典型血友病患者常自幼年发病、自发或轻度外伤后出现凝血功能障碍，出血不能自发停止；从而在外伤、手术时常出血不止，严重者在较剧烈活动后也可自发性出血，特别是出血关节、肌肉等出血，导致严重的关节肿胀及肌肉缺血坏死，长期发作
4、可以影响骨关节的生长发育，导致关节畸形及肌肉萎缩，以致四肢（主要为下肢）活动困难，严重者不能行走。血友病的出血特点为： （1） 出血不止：多为轻度外伤、小手术后；（2） 与生俱来，伴随终身；（3） 常表现为软组织或深部肌肉内血肿；（4） 负重关节膝、踝关节等反复出血甚为突出，最终可致关节畸形，可伴骨质疏松、关节骨化及相应肌肉萎缩(血友病关节)。（5） 出血的轻重与血发病类型及相关因子缺乏程度有关。血友病患者平常看起来与常人无异，只是在出血时比较容易陷入危险。甲型血友病严重程度分型 分型活性(%)临床出血特点重型1关节、肌肉、深部组织出血，关节畸形，假肿瘤；可有咯血，呕血，颅内出血中型1-5关节
5、、肌肉、深部组织出血，关节畸形，较轻轻型5-25关节、肌肉出血很少，无关节畸形亚临床型25-45仅在严重创伤或手术后出血血友病A的发病机制及治疗血友病A ( hemo philia A) 又名甲型血友病, 是一种X.连锁隐性遗传病, 在男性中的发病率约为( 1 2) / 10000。血友病A 的临床症状主要是自发性或创伤性出血, 尤其是肌肉和关节出血、血肿, 常可致残, 甚至可因颅内和关节出血而危及生命。血友病A 的致病机制是由于编码凝血因子 ( 简称F ) 的基因先天性异常而导致的凝血因子 缺乏或功能缺陷。血友病A 传统的治疗方式是补充富含F 的血浆制品, 虽具一定疗效, 但存在病毒污染(
6、HIV、HBV ) 的风险以及需终身治疗的局限性。另外, 由于F 在人体内半衰期较短、纯化及重组的F 制品昂贵和需要反复输注等困难, 都使得蛋白替代疗法受到一定限制。约23%的重型血友病A 患者由于反复输注F 制品而产生F 抑制性抗体( 主要是IgG) , 这也是一个难以解决的问题。基因治疗可作为血友病A 新的治疗方式基因治疗作为一种新的治疗方式, 给血友病A 的治疗提供了新的思路。所谓基因治疗, 是指将正常基因转入靶细胞代替遗传缺陷的基因, 或关闭、抑制异常表达的基因, 达到预防和治疗疾病目的的一种临床治疗技术。对于由基因缺陷而导致的疾病, 理想的基因治疗策略就是要达到精确的! 基因修复.
7、, 即将目的外源DNA 片段引入细胞, 在人基因组的特定部位上( 目的基因的缺陷处) 进行定点重组( 即基因打靶) , 修复后的基因能稳定持久地正确合成有活性的目的功能蛋白; 另一种策略就是! 基因替代. 治疗, 即将有功能的正常基因转移到缺陷细胞中, 合成出目的蛋白以代替缺陷基因发挥作用, 亦即传统的基因治疗。目前血友病A 基因治疗多采用这种! 基因替代. 的治疗策略。对血友病A 进行基因治疗有几个主要原因: 2 . 病毒载体介导的血友病A 基因治疗逆转录病毒载体因其可以稳定整合到宿主细胞染色体、能感染多种细胞、免疫原性低等特点, 而成为最为常用的载体之一。Moayeri M 2 等构建了一
8、种逆转录病毒载体, 该载体是一种经过优化的Moloney 小鼠白血病病毒载体( MSCV ) , 其中携带了改造的hF , 并通过内部核糖体进入位点序列( inter nal ribosome ent ry site, IRES) 与增强型绿色荧光蛋白( enhanced g reen fluorescent pro tein, EGFP) 基因连接成共同表达盒。3.直接注射含有基因的质粒血友病B发病机制及检测血友病B(hemophilia B，HB)是凝血因子(factor ，F )基因突变引起血浆F量的缺乏或质的缺陷所导致的一种X连锁隐性遗传性出血性疾病，在男性中的发病率约为1/30000
9、，是一种严重危害人民健康的疾病。由于目前尚缺乏针对本病的根治措施，故开展基因诊断及携带者检出无疑是防止新的患儿出生、阻断有害基因传递、提高人口素质的一个有效手段。本研究旨在从基因水平对HB患者及携带者做出诊断，探讨HB的分子发病机制。 检测方法: 1采集3个无血缘关系的HB家系先证者及成员外周静脉血，提取基因组DNA。2选择距离F2cM内的6个STR位点，采用多重PCR及荧光标记引物扩增各STR位点片段，检测先证者及其家系成员6个STR位点的基因多态性，进行家系遗传连锁分析。 3根据F基因序列，利用Primer 5软件共设计8对引物，采用PCR法对先证者及可疑携带者F基因8个外显子及其侧翼序列
10、进行扩增，运用双脱氧链终止法在ABI3700测序仪上对PCR产物进行测序，利用Chromas软件将测序结果与正常序列进行比对，寻找基因突变。检测结果: 1联合6个STR位点对3个HB家系进行检测，根据先证者的基因型，共发现9名可疑携带者，她们均有一条与先证者同源的X染色体。但基因测序证实，家系1、3可疑携带者的F基因中并不存在与先证者相同的基因缺陷，结合先证者的临床和病史特点，考虑其基因缺陷可能由自发性突变产生。家系2可疑携带者的F基因中发现了与先证者相应位点相同的杂合突变，STR位点基因多态性检测结果与基因测序结果一致，说明先证者的基因缺陷遗传自其母亲。 2利用PCR法及基因测序技术，在3例
11、先证者的F基因中均发现了相应的错义突变：家系1先证者外显子6发现G22119A(侧翼序列的剪切位点)点突变，家系2先证者外显子2发现G7932C(Glu8Asp)点突变，家系3先证者外显子8发现T32685C(Cys336Arg)点突变。G22119A发生在外显子6侧翼序列的剪切位点，使F不能被正常剪切，从而影响其正常生理功能。T32685C发生在外显子8，该部位编码丝氨酸蛋白酶催化区，存在F与F的结合位点，可能是由于氨基酸的改变影响了F蛋白在细胞内的合成与分泌，导致F功能缺陷。G7932C发生在外显子2，导致Glu突变为Asp，影响了F与Ca2+依赖性磷脂的结合。 结论: 1F基因缺陷是HB
12、的分子发病机制。 2联合多个STR多态性位点对HB家系携带者进行间接诊断，是一种简便、有效、快捷的方法；但是，对于无家族史的散发家系来说，通过遗传连锁分析做出诊断时仍有可能出现误差。 3基因测序技术是诊断HB患者及携带者最直接、最精确的方法之一。血友病的诊断方法（一）直接基因诊断：采用分子生物学方法(PCR，DGGE，SSCP，DNA测序等)直接测定致病基因的缺陷。FVIII 22内含子倒位分析可作为重型HA的筛选试验，也是目前唯一用于临床诊断的直接基因检测方法。FVIII 22内含子倒位和其它一些基因突变常伴有抑制物发生，因此有助于预测抑制物的产生。（二）间接基因诊断：利用致病基因内外的限制
13、性片段长度多态性（RFLP）作为特异分子遗传标志物，通过家系成员间的连锁关系确定血友病基因的遗传情况，进行DNA多态性分析的遗传学诊断(RFLP，VNTR，STR等方法)，可使诊断率达99%。RFLP分析的局限性：必须具有先证者的标本；母亲系该多态位点的杂合子，联合多个RFLP才可诊断。（三）产前诊断：对高危胎儿可在妊9-12周通过绒毛膜活检；妊12-16周进行养水穿刺，近来还可在胚胎植入前通过早期胚胎（8个细胞时）获取胎儿DNA，通过DNA基因型和遗传表型确定胎儿性别，以及进一步判断是否为血友病或携带者。妊18-20周可在胎儿镜下取脐静脉血，测定FVIII:C和FVIII:Ag。上述方法都存在流产的危险（约0.5%-1%）, 需在妇产科医生的指导与配合下进行。利用流式细胞术（FACS）测定母体静脉血中的胎儿特异性单克隆抗体以确定胎儿性别，提供了早期，无创性产前诊断的方法。血友病遗传图谱5
